- 1. Патогенез ВБНК і проблеми його вивчення Варикозна хвороба нижніх кінцівок (ВБНК) - широко поширена...
- Дослідження Всього спектру мРНК
1. Патогенез ВБНК і проблеми його вивчення
Варикозна хвороба нижніх кінцівок (ВБНК) - широко поширена патологія судин, яка трапляється в середньому у 25-50% жінок і 10-30% чоловіків [1-3]. Дані про поширеність захворювання варіюють від дослідження до дослідження, що, по всій видимості, пов'язано з особливостями досліджуваних вибірок, в першу чергу з різним впливом факторів ризику, головними з яких є жіноча стать, вік, сімейний анамнез захворювання, вагітність, а також ожиріння і тривалі статичні навантаження у вертикальному положенні.
Вивченню патогенезу ВБНК присвячено безліч досліджень, і на сьогодні накопичено значний масив знань про події, що супроводжують варикозну трансформацію на різних рівнях, починаючи з генного і молекулярного [2, 4]. До чинників, який впливає на цей процес, відносяться зміни гемодинаміки: зниження ламінарної швидкості потоку крові і поява турбулентного кровотоку, підвищення венозного тиску і пов'язане з ним розтягнення стінок вен, гіпоксія, оксидативний стрес, активація ендотелію і запалення [2, 4-8] . Ці фактори взаємопов'язані з безліччю молекулярних і клітинних подій, таких як: зміна експресії генів, в тому числі генів ферментів, які здійснюють ремоделінг позаклітинного матриксу, і генів самих компонентів матриксу; акумуляція цитокінів та ростових факторів; зміна фенотипу гладком'язових клітин і їх проліферація; інфільтрація імунних клітин. В кінцевому рахунку всі ці процеси опосередковують структурні та морфологічні зміни стінки вени, порушують її функцію. Проте накопичена на сьогоднішній день інформація не дозволяє скласти повну і несуперечливу картину розвитку ВБНК. Перш за все все ще незрозуміло, як саме відбувається ініціація захворювання і в якому порядку виникають патологічні зміни в венозної стінки. Наприклад, такий фактор, як амбулаторна венозна гіпертензія, яку часто називають причиною захворювання, очевидно, відсутня на самих ранніх стадіях захворювання, коли кровотік ще не порушений. Раніше передбачалося, що саме цей фактор є ключовим, оскільки первинною патологією вважали недостатність венозних клапанів і рефлюкс, але ультразвукові та гістологічні дослідження спростували цю гіпотезу [8, 9]. Можливо, архітектура стінок вен, схильних до варикозної трансформації, спочатку інша, і такі вени патологічно відповідають на природні навантаження і провокуючі фактори, наприклад перепад тиску або тривале положення стоячи. Гіпертензія в такому випадку може бути наслідком ослаблення стінок вен, і її роль, можливо, зводиться до участі в прогресії захворювання як просто одного з проміжних етапів патогенезу. Не до кінця зрозуміла роль і ряду інших патогенетичних факторів, оскільки зробити однозначні висновки заважають протиріччя в результатах досліджень. Наприклад, залишається відкритим питання про роль запалення на початкових етапах розвитку ВБНК. У двох роботах, виконаних на матеріалі пацієнтів, що мають ранні стадії захворювання (С2 і С3, переважно С2), отримані протилежні результати. У першому дослідженні показано збільшення рівня маркерів запалення в крові з варикозних вен в порівнянні зі здоровими [10], у другому не продемонстрували жодних ознак розвивається запалення в стінках уражених вен - ні підвищення концентрації медіаторів запалення, ні присутності імунних клітин [11]. Точно так само не до кінця зрозуміла роль гіпоксії і її причинно-наслідковий зв'язок з іншими факторами. Існує багато свідчень на користь того, що гіпоксія пов'язана з варикозної трансформацією, але при цьому лише в одній роботі безпосередньо виміряно вміст кисню в стінках хворих і здорових вен і показано його зниження при варикозному розширенні [7]. Таким чином, незважаючи на значну кількість науково-дослідних робіт, точних уявлень про патогенез ВБНК досі немає, як немає і єдиної думки про її причини, тому потрібні подальші дослідження в цьому напрямку.
2. Аналіз диференціальної експресії генів як один з аспектів дослідження патогенезу ВБНК
Ген-кандидатних дослідження
Одним із способів вивчення молекулярних основ розвитку захворювання є дослідження диференціальної експресії генів. Ідентифікація генів, які змінюють свою активність при патології, допомагає зрозуміти, які функціональні системи задіяні в розвитку патологічного процесу. У перспективі цей підхід створює науковий базис для розробки нових лікарських препаратів. Роботи з аналізу диференціальної експресії генів при ВБНК проводяться з початку 2000-х років і тривають в даний час. Більшість робіт виконано в форматі ген-кандидатних досліджень (табл. 1).
Таблиця 1.Ісследованіе диференціальної експресії генів при варикозної хвороби нижніх кінцівок, в яких реалізований ген-кандидатних підхід (наведені в хронологічному порядку). У дужках вказані альтернативні назви генів Примітка. Тут і в табл. 2: ↑ - експресія збільшена, ↓ - експресія знижена; * - аналізували культури гладком'язових клітин, отриманих із зразків вен; ** - група контролю - зразки здорових вен від тих же пацієнтів з ВБНК. При такому підході гени вибирають, виходячи з припущень про потенційних учасників процесу. Класичні методи, використовувані для такого типу досліджень, - це зворотна транскрипція сумарною мРНК, виділеної з біологічних зразків, напрацювання цільового фрагмента ДНК за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ЗТ-ПЛР), візуалізація продукту той чи інший спосіб і порівняльний аналіз отриманих даних. Для нормування на кількість матеріалу в зразку зміст шуканого транскрипта вимірюється щодо кількості мРНК референсного гена, коливання експресії якого в клітинах тканини вважаються незначними. На початку століття для візуалізації продуктів ПЛР використовували в основному електрофоретичної поділ з подальшим фарбуванням (наприклад, бромистим етидієм). Цей метод дозволяв зробити тільки приблизні оцінки щодо рівня експресії і не претендував на абсолютну кількісну точність. У міру розвитку методів молекулярної біології все більш доступною ставала ПЛР в режимі реального часу, що дозволяє проводити точну кількісну оцінку, і зараз для аналізу експресії одного або декількох генів використовують переважно саме цей метод. Існують і інші не засновані на ПЛР методи. Вони менш поширені, і з 23 ген-кандидатних досліджень експресії генів при ВБНК лише в одній роботі застосована методика, заснована на гібридизації РНК зі специфічною міченої пробою, що захищає цільову мРНК від дії рибонуклеаз [12] (див. Табл. 1). 
Як матеріал для аналізу в основному використовували зразки вен, віддалених в ході хірургічного лікування ВБНК. Контрольна група зразків найчастіше складалася із сегментів вен, використаних для аутовенозного шунтування (аортокоронарного і ін.), У пацієнтів без венозної патології. У рідкісних випадках контрольними зразками служили вени, отримані при ампутація [12] і від мультиорганної донорів [13]. В одному дослідженні в якості контролю були взяті здорові ділянки вен тих же пацієнтів, у яких брали дослідні зразки [14]. Нарешті, в 2 дослідженнях, завданням яких було виміряти експресію саме в клітинах гладеньких м'язів, були попередньо отримані клітинні культури, з яких в подальшому виділяли мРНК [15, 16]. Варто відзначити, що в більшій частині ген-кандидатних дослідженнях вимір експресії генів на рівні мРНК було лише одним з етапів роботи. Роль генів і закодованих в них білків оцінювали комплексно: крім аналізу кількості транскрипта, визначали вміст в зразках власне білкового продукту методами іммуногістіхіміческого фарбування, вестерн-блот та ін. (Див. Табл. 1).
У ряді робіт [15-19] увага була сфокусована на генах, що кодують компоненти позаклітинного матриксу (еластин (ELN), фібулін 5 (FBLN5) і ферменти, відповідальні за його біогенез і ремоделінг - триптазу II (TPSB2), лізил-оксидазу (LOXL 1), різні матриксних металлопротеінази (MMP1, MMP2, MMP3, MMP9, MMP13) і їх тканинні інгібітори (TIMP1 і TIMP2). Не у всіх роботах [18, 19] гіпотези підтвердилися експериментально. В цілому система позаклітинного матриксу при ВБНК набагато краще вивчена в ген-кандидатних дослідженнях на рівні білків, ніж на рівні мРНК, і, не дивлячись на деякі протиріччя в результатах, дані про порушення балансу в цій системі досить переконливі [8].
Багато досліджень присвячено аналізу експресії генів різних ростових факторів і їх рецепторів. Показано збільшення активності гена кислого фактора росту фібробластів (FGF1) - проангіогенних молекули, важливого регулятора клітинної проліферації, міграції та диференціювання, задіяного також в регуляції експресії і активності матриксних металопротеїназ [14]. В 4 роботах продемонстрована підвищена експресія гена іншого ангиогенного фактора - зростання ендотелію судин (VEGF) [20-23] і його рецепторів KDR (VEGFR 2) і FLT 1 (VEGFR 1) [20]. Як і FGF-1, VEGF, крім свого мітогенного ефекту щодо ендотеліальних клітин, регулює активність матриксних металопротеїназ, а також збільшує проникність судин і стимулює експресію адгезійних молекул на поверхні ендотелію. Ще один плейотропний фактор росту, що активується при ВБНК, - це трансформуючий фактор росту TGF-β1 [24]. Підвищена експресія виявлена також для гена його рецептора TGF-β RII (TGFBR2) [25]. Цей цитокін також залучений в ремоделінг судин і регулює проліферацію, диференціювання та міграцію гладком'язових клітин і фібробластів. Можливо, порушенням балансу факторів зростання пояснюється аномальна проліферація гладком'язових клітин в гіпертрофованих сегментах варикозних вен і зміна їх фенотипу з скорочувального на секреторний.
Функціонування ростових факторів TGF-β1 і VEGF взаємопов'язане з індукованим гіпоксією транскрипційним фактором 1 (HIF-1), що складається з субодиниці HIF-1α і ядерного транслокатора ARNT (HIF-1β). Експресія VEGF находітcя під контролем HIF-1. TGF-β1 і HIF-1α взаємно активують один одного і регулюють частково перекривається спектр генів, в тому числі VEGF. У двох роботах була вивчена активність гена білкової субодиниці HIF-1α (HIF1A) [22, 23] та інших генів цієї системи: HIF2A, генів-мішеней HIF-1α - GLUT1 (регулює обмін глюкози), CA9 (регулює pH) і BNIP3 ( проапоптотического білок), а також генів інгібіторів HIF-1α - гідроксилази PHD1, 2, 3 і FIH1 [23]. Результати робіт підтвердили гіпотезу про активацію відповіді на гіпоксію при ВБНК.
Цікаві результати отримані в роботах групи авторів S. Surendran і співавт. [26, 27]. І на рівні мРНК, і на рівні білків була показана активація компонентів сигнального шляху FOXC2-Dll4-Notch-Hey2, що генерує проліферативний сигнал, для гладких клітин. Цей сигнальний шлях характерний для артерій, і авторами також було продемонстровано збільшення експресії артеріального маркера ефріна B2 (EFNB 2) в варикозно-змінених венах. Ймовірно, патологічна «артеріалізація» вен є відповіддю на гемодинамічні зміни і розтягнення венозних стінок. Крім цього, виявлено гіперекспресія маркера гладком'язових клітин і миофибробластов - віментину (VIM), в той час як маркер ендотеліальних клітин CD 31 експресуватися менше, ніж в контрольних зразках. Автори припустили, що це може бути пов'язано з ендотеліально-мезенхимальной транзіциі.
У двох роботах були проаналізовані гени, відповідальні за регуляцію апоптозу, - p21, BAX, TP53, BCL2 [13, 16] і каспаз-3 (CASP3) [16] в тканини здорових і хворих вен і на культурах гладком'язових клітин. В обох роботах була показана гіперекспресія антиапоптотического гена BCL2 в клітинах варикозних вен. Експресія інших генів залежала від ділянки вени і віку випробовуваних. У дослідженні, виконаному на клітинних культурах, експресія антиапоптотических генів була підвищена, а проапоптотических - знижена. Результати цих та інших робіт в цій галузі свідчать, що порушення балансу індукторів та інгібіторів апоптозу може лежати в основі фенотипічних і функціональних змін, характерних для гладких клітин в стінках вен при ВБНК, знижувати венозний тонус і приводити до виникнення ділянок гіпертрофії і атрофії.
Експресія генів, що кодують хемоаттрактанти для моноцитів / макрофагів і нейтрофілів (MCP 1, IL 8, CCL 5, CXCL 10, CCL 3, CCL 4), була вивчена в дослідженні L. del Rio Sola і співавт. [12]. Варто зазначити, що пацієнти, які надали матеріал, мали в основному ранні стадії захворювання. Транскрипція всіх вивчених генів в зразках ВБНК була вище, ніж в нормальних венах, що узгоджується з рядом інших досліджень [10, 28], які виявили індукцію запальної відповіді при варикозі. Проте, як було згадано вище, є роботи і зі зворотнім результатом [11].
В інших дослідженнях було показано збільшення експресії генів, що беруть участь в продукції вазоактивних сполук [29], регуляції клітинної міграції (IQGAP1) [30] і циркадних ритмів (CLOCK) [22], а також зниження експресії гена тирозинкінази Tie-1, що грає важливу роль в ангіогенезі [31]. Виявлено пригнічення експресії генів NELIN і SM22-α (TAGLN), що вказує на фенотипічну транзіциі гладком'язових клітин [32]. Нарешті, продемонстрована індукція експресії генів рецепторів естрогену ER-α, ER-β і GPER1, корелює зі стадією захворювання [33].
Дослідження транскрипционной активності генів-кандидатів, безумовно, додали багато нової інформації до знань про патогенез ВБНК. Проте вони не позбавлені недоліків, як і сам підхід в цілому. По-перше, досвідчені і контрольні групи, як правило, мали невеликий розмір, що в поєднанні з великою кількістю тестів в деяких роботах призвело до проблеми введення поправки на множинне порівняння. Якщо різниця в експресії невелика, а зразків трохи, потужності дослідження може апріорі не вистачити для досягнення високого рівня статистичної значущості. В такому випадку критерієм достовірності відкриття може служити тільки незалежне підтвердження. Однак в більшості робіт результати аналізу транскриптов підтверджені на рівні білків, іноді декількома методами. По-друге, не у всіх дослідженнях матеріал був детально описаний, зокрема не вистачало інформації про клас захворювання. Цілком можливо, що рівень експресії змінюється в залежності від стадії захворювання, а також від того, який сегмент вени був підданий аналізу. Логічно припустити, що в зонах гіпертрофії і атрофії гени можуть вести себе по-різному. По-третє, майже у всіх роботах експресія була виміряна щодо одного референсного гена, і якщо припустити, що його активність могла коливатися, то існує ймовірність хибнопозитивних або помилково негативні результати. По-четверте, головний недолік ген-кандидатних підходу - це залежність від гіпотези, що автоматично накладає обмеження на можливості методу, тому що не всіх учасників процесу можливо передбачити.
Дослідження Всього спектру мРНК
Альтернативний підхід до Вивчення діференціальної експресії - аналіз одночасно всех наявний транскриптов и поиск відмінностей между контрольно и досліднімі зразки. Одним з дере таких методів ставши діференційній дисплей мРНК. ВІН Включає кілька етапів: віділення сумарної мРНК, зворотнього транскріпцію, ПЛР-ампліфікацію фрагментів всієї отріманої комплементарної ДНК, поділ амплікон в поліакріламідному гені и порівняння їх профілів. Если Відмінності между групами віявлені, Цільові фрагменти віділяють з гелю, визначаються їх послідовність та анотує. Оскільки для методу характерна велика кількість хибнопозитивних сигналів, результати потім перевіряють іншими способами, наприклад ОТ-ПЦР [34]. Перший диференційний дисплей для ВБНК дозволив ідентифікувати три кДНК, гомологічних повторам LINE1 і Alu, один з яких лежить в гені тропомиозина TPM 4 [35]. У дослідженні було проаналізовано 4 зразка вен від пацієнтів з ВБНК класу C2 і 3 контрольних зразка вен від здорових пацієнтів. Підтвердження результатів додатковими способами в цьому дослідженні не проводили.
У наступній роботі групи мали більший розмір, 12 пацієнтів (клас С2-С4) у вибірці «випадок» і 9 чоловік в групі «контроль» [36]. Аналіз виявив зниження експресії гена десмусліна, також відомого як сінемін (SYNM), причому результат був підтверджений методом ЗТ-ПЛР, гибридизацией РНК по Нозерн і імуногістохімічним аналізом білкового продукту гена в клітинах гладеньких м'язів. Сінемін є білком цитоскелету сімейства проміжних філаментів, відповідальних за стійкість до механічних навантажень. Ймовірно, низька активність цього гена в гладкої мускулатури вен є однією з причин ослаблення венозної стінки і зниження її тонусу при варикозі.
У третій аналогічній роботі дисплей мРНК проаналізували для трьох зразків - двох досвідчених і одного контрольного [37]. З кількох диференційно експресуються генів вибрали один, який показав найбільшу різницю в рівні мРНК, а саме POU 2 F 1, що кодує транскрипційні фактор Oct-1. Гіперекспрессію гена при ВБНК підтвердили методами ВІД-ПЛР і вестерн-блот, включивши в вибірки додаткову кількість зразків (15 і 4 в групах «випадок» і «контроль» відповідно). Oct-1 активний у всіх клітині і регулює транскрипцію багатьох генів, в тому числі здійснюють контроль клітинного циклу. Автори дослідження припустили, що зв'язок Oct-1 з варикозом може бути обумовлена акумуляцією клітин з порушеною функцією, які уникли апоптозу, але в зв'язку з плейотропних дією цього фактора механізмів може бути багато.
Крім високої ймовірності хибнопозитивних результатів, недоліками методу диференціального дисплея мРНК є мала ефективність аналізу складних наборів мРНК, переважне виявлення широко представлених транскриптов і висока залежність інтерпретації результатів від досвіду дослідника [34]. Сучасні високотехнологічні методи аналізу дозволяють уникнути цих обмежень. До теперішнього часу в відношенні ВБНК опубліковано три дослідження, в яких застосували технології ДНК-мікрочіпів (мікроерреев) для повномасштабного скринінгу диференціальної експресії генів [38-40]. Цей метод заснований на гібридизації кДНК з тисячами іммобілізованих олігонуклеотидних проб з відомою послідовністю. Результати робіт, в яких використовували цей метод, представлені в табл. 2.
Таблиця 2. Дослідження диференціальної експресії генів при варикозної хвороби нижніх кінцівок за допомогою технології ДНК-мікрочіпів. Назви генів можуть відрізнятися від опублікованих в статтях в зв'язку номенклатурними змінами, а також переглядом деяких даних в базі GenBank У перших двох дослідженнях ДНК-мікрочіпи містили, за сучасними мірками, невелика кількість проб - 2000-3000. В роботі C. Cario-Toumaniantz і співавт. [39] мікрочіповие метод поєднали з супрессивной вичітательной гибридизацией [34], за допомогою якої були отримані бібліотеки кДНК, збагачені диференційно експресуються генами. Ці бібліотеки потім використовували для приготування мікроеррея. Клони, відповідні послідовностям на чіпі з найбільшою різницею в експресії за підсумками експериментів, секвенували і співвідносили з відомими генами. У третьому, найбільшому дослідженні експресія генів при ВБНК була проаналізована вже на рівні повного генома (близько 38 500 генів) [40].
Ми порівняли результати, отримані в мікрочіпових дослідженнях, з даними ген-кандидатних робіт, диференціальних дисплеїв мРНК і між собою з урахуванням того, що багато генів мають альтернативні назви. Головний висновок, який можна зробити з цього порівняння, - це дивно низька відтворюваність результатів. У трьох роботах, які застосували технологію мікроерреев, тільки один ген був виявлений більш ніж в одному дослідженні - це ген селенопротеіна SEPP1, що кодує гепарин-зв'язуючий позаклітинний білок. Перетин з результатами ген-кандидатних робіт було виявлено тільки для гена тканинного інгібітора матриксних металопротеїназ TIMP 1 [16, 39]. Для гена актин-зв'язуючого білка SMC22-α (трансгеліна, TAGLN), який є раннім маркером диференціювання гладком'язових клітин, результати виявилися протилежними: в ген-кандидатних дослідженні його експресія була знижена при ВБНК [32], в мікрочіповие - збільшена [38]. Ще одна визначна спостереження - це виявлення диференціальної експресії генів глицеральдегид-3-фосфатдегідрогенази GAPDH [38] і β-актину ACTB [39], які використовувалися в більшості ген-кандидатних робіт як референсні (для всіх типів аналізу). Якщо їх рівень їх експресії нестабільний, то це могло призвести до спотворення результатів. Додатково ми порівняли експресійної дані з результатами недавнього протеомних дослідження, в якому увага була сфокусована на компонентах позаклітинного матриксу [41]. Збіги були виявлені для колагену типу I, альфа 1 (COL 1 A 1) [38], гельзоліна (GSN) [39] і TGF-β-индуцируемого білка (TGFBI) [38] - їх продукція була збільшена. Для чотирьох генів ефекти відрізнялися: на рівні мРНК експресія кластеріна (CLU) [39], колагену типу III, альфа 1 (COL 3 A 1) [39], дерматопонтіна (DPT) [39] і люмікана (LUM) [38] була підвищена, на рівні білків - знижена [41].
Всі ці протиріччя наочно ілюструють проблеми, характерні для цієї галузі досліджень. Складно очікувати, що всі без винятку варикозно-змінені вени будуть однакові за рівнем генної активності, тому чим більше інформації представлено про клас ВБНК, вік і стать пацієнтів, локалізації досліджуваних сегментів, тим простіше зіставити результати різних робіт і зрозуміти причини відмінностей. Друга проблема - це екстраполяція даних по транскрипт на рівень білків. Відмінності в кількості транскриптов в клітці зовсім не обов'язково зберігаються на рівні кінцевих продуктів генів, і, навпаки, різна представленість білків не завжди означає різну Транскрипційні активність, оскільки, крім транскрипційного рівня регуляції генної експресії, існує ще і трансляційний та посттрансляційних [42]. У згаданому вище протеомних дослідженні спостерігали такий ефект [41]. Для ряду білків, по-різному представлених в варикозних і нормальних венах, виміряли вміст мРНК в зразках, і різницю підтвердили тільки для двох генів - мімекана і аггрекана. Зокрема, не виявили відмінностей в експресії для COL 1 A 1, COL 3 A 1, DPT і LUM. Проте інформація про генної експресії, безумовно, є важливою, оскільки дає загальне уявлення про системи, які активуються або придушуються в клітинах і тканинах при захворюванні. Такі знання можна почерпнути з комплексного аналізу даних, отриманих в ході експресійних досліджень, а також при сукупному аналізі даних по протея. Для цього зараз вже запропоновано біоінформатіческіе підходи [42].
У цій роботі ми об'єднали результати ДНК-мікрочіпових досліджень і виконали їх функціональну анотацію, проаналізувавши представленість в переліку диференційно експресуються генів категорій «генної онтології». Проект «Генна онтологія» (Gene Ontology) створений з метою систематизації та уніфікації біологічних знань, для чого були розроблені специфічні «словники», в які входять «терміни» - групи генів, об'єднані за загальними функціональними ознаками [43]. Таких словників три - «Біологічний процес», «Молекулярна функція» і «Клітинний компонент». Терміни в словниках пов'язані між собою через відносини різного типу ( «А є частиною В», «А є окремим випадком В» і ін.). Кожен ген можна віднести до одного або декількох термінів всередині словників, тим самим охарактеризувавши його роль в життєдіяльності організму. База даних «генної онтології» постійно оновлюється і редагується в міру отримання нових біологічних даних і уточнення старих, тому терміни динамічні і можуть змінювати свій склад.
Представленість функціональних груп генів (терміни) у списку аналізують за допомогою біоінформатіческіх алгоритмів під загальною назвою Gene Set Enrichment Analysis (дослівно: аналіз збагачення набору генів). Сенс методу полягає в статистичному порівнянні числа генів зі списку, що потрапили в ту чи іншу категорію, з їх теоретично очікуваним кількістю в цій групі. Ми виконали такий аналіз за допомогою інструменту PANTHER Overrepresentation Test системи PANTHER, яка є частиною консорціуму «генної онтології» [44]. Додатково ми проаналізували дані за допомогою аналогічного інструменту на платформі geneXplain (http://genexplain.com/). Результати, одержані за допомогою різного програмного забезпечення, можуть відрізнятися один від одного, що пояснюється різницею в застосовуваних алгоритмах і використанням різних версій «словників» з бази даних. У зв'язку з цим ми представили категорії, які були виявлені одночасно обома інструментами (табл. 3).
Таблиця 3. Функціональна анотація генів, диференційно експресуються в варикозно-змінених венах нижніх кінцівок, виявлених за допомогою технології ДНК-мікрочіпів (дата аналізу: 11.10.17) Примітка. * - ідентифікаційний номер терміна генної онтології; ** - c урахуванням поправки на множинне порівняння. 
Категорії генів, якими був збагачений досліджуваний список, в цілому відповідали передбачуваним або вже продемонстрованим функціональним особливостям варикозної хвороби. Багато терміни були так чи інакше пов'язані з організацією клітинних і позаклітинних структур - цитоскелету, позаклітинного матриксу, взаємодією компонентів матриксу з клітинами і між собою (зокрема, такими були всі терміни словника «молекулярна функція»). Серед біологічних процесів багато термінів відносилося до відповіді на вплив різних органічних молекул, в тому числі цитокінів. Очікувано було виявити терміни «розвиток тканин», «скорочення гладком'язових клітин», «клітинна адгезія» і «регуляція клітинної міграції». Все це не дивно, оскільки головна характеристика ВБНК - це патологічний ремоделінг. Примітно, що значне збагачення було показано для категорій, які мають відношення до гемостазу, таких як власне «гемостаз», «дегрануляция тромбоцитів», «аггрегаціі тромбоцитів» і ін. Тромбофлебіт поверхневих вен є одним з основних ускладнень варикозної хвороби. Можливо, це пов'язано з пошкодженням ендотеліальних клітин і вивільненням факторів згортання. Існує взаємозв'язок і з тромбозом глибоких вен: варикозне розширення вен може розвиватися вдруге в результаті посттромботической порушень кровотоку. І, навпаки, у пацієнтів, які страждають ВБНК, ризик тромбозу глибоких вен трохи збільшений [45]. На жаль, нам складно судити про причинно-наслідкові зв'язки між експресією генів цієї системи і варикозної трансформацією, оскільки, по-перше, не у всіх ДНК-мікрочіпових дослідженнях були наведені класи захворювання (теоретично, у частини пацієнтів могли вже бути трофічні виразки), по-друге, лише в одній роботі автори вказали, що вивчали саме первинне варикозне розширення вен [38]. Варто також відзначити, що гени з тестованого переліку, завдяки яким відбулося збагачення категоріями системи гемостазу, аж ніяк не є специфічними для процесів згортання. Це ті ж гени колагену, тубулінів, актинії, кластеріна, калюменіна та інших білків.
Ще одна цікава і несподівана знахідка - це виявлення молекулярних шляхів, пов'язаних з вірусом грипу (див. Табл. 4). Такий результат вийшов через високу представленості генів деяких рибосомних білків, таких як RPL 13 A і RPSA, в списку генів з диференціальної експресією. Рибосомальні білки взаємодіють з РНК-залежною РНК-полімераза вірусу, необхідної для його реплікації [46]. Чи є якась біологічна основа під цим збагаченням або це просто випадковий перетин молекулярних шляхів, сказати важко. Тим більше ми не знаємо, чи може сам вірус впливати на експресію генів даних білків. Оскільки вірус грипу здатний вражати ендотелій судин, можна все ж припустити, що між цими захворюваннями є якась взаємодія. Аналогічно цьому високу збагачення категорією «розвиток чорної речовини» (substantia nigra), можливо, пояснюється просто випадковим збігом, так як ця маленька група включає всього 43 гена, з яких в нашому списку - 5 (див. Табл. 3).
Аналіз диференціальної експресії генів при ВБНК - один з інструментів вивчення її патогенезу, який застосовується вже майже два десятки років. У комплексі з іншими видами досліджень цей підхід допоміг сформувати сучасні уявлення про молекулярні основи варикозної трансформації, підтверджуючи або спростовуючи гіпотези і відкриваючи нових учасників цього процесу. Більшість робіт в даній області проведено в форматі ген-кандидатних досліджень (на сьогоднішній день - 23 публікації в електронних базах даних), але є і роботи з пошуку генів «наосліп», без початкової гіпотези. В одній з них диференціальна експресія проаналізована на рівні повного генома [40]. В цілому як для самого підходу, так і для окремих робіт характерні деякі недоліки. Аналіз експресії генів дозволяє встановити, які зміни відбуваються при патології, але не розмежовує причину і наслідок, тому не може відповісти на актуальне в даному випадку питання: що запускає розвиток хвороби? Теоретично цей підхід дає можливість з'ясувати, в якому порядку виникають порушення при прогресії захворювання. Але для цього необхідно аналізувати чітко охарактеризовані групи зразків, що відносяться до різних етапів розвитку ВБНК. Недостатньо детально описані вибірки - це ще одна проблема, властива роботам в цій області. Відсутність інформації про клас варикозної хвороби, локалізації сегмента вен і їх характеристиках (первинне або вторинне ураження), про вік пацієнтів - все це ускладнює порівняння результатів і заважає зрозуміти причини, чому дані не відтворюються або навіть протилежні. Безумовно, на це слід звернути увагу в подальших дослідженнях.
Дослідження виконано за фінансової підтримки Російського наукового фонду в рамках наукового проекту № 17-75-20223 «Дослідження механізмів ремоделювання стінки вени при її варикозному розширенні».
Автори заявляють про Відсутність конфлікту інтересів.
Відомості про авторів
Шадріна А.С. E-mail: [email protected] ORCID: http://orcid.org/0000-0003-1384-3413;
Сметаніна М.А. ORCID: http://orcid.org/0000-0001-6080-4615;
Золотухін І.А. ORCID: http://orcid.org/0000-0002-6563-0471;
Селіверстов Є.І. ORCID: http://orcid.org/0000-0002-9726-4250
