1 Могильна Г.М. 1 Фомічова Є.В. 1 Терехов А.Я. 2 Блатт Ю.Є. 2
1 ГБОУ ВПО «Кубанський державний медичний університет»
2 ТОВ «Мерц ФАРМ»
В експерименті вивчено морфологічні перетворення, що відбуваються в дермі в зоні введення препаратів Радіесс (Merz) і Люмінера (Ізраїль). Препарати вводили субдермальних щурам-самцям в обсязі 0,05 мл, оцінку результатів проводили через 2 тижні. Зрізи фарбували гематоксиліном і еозином, для виборчого виявлення ДНК використовували реакцію Фельгена. Для виявлення колагенових волокон використані забарвлення по Ван-Гизону, Маллорі і Массон (Pears, 1969). З метою типування фібрилярних структур дерми була використана забарвлення ПІКРИТ-Сиріусом червоним по Dayan et all (1989). Проведена морфометрія мікросфер і дана оцінка їх оптичної щільності. Показано, що динаміка змін зачіпає характеристику мікросфер, цитогенной строму навколо них, статус аморфного компонента, причому реакція компонентів дерми на різні філери відрізняється разнонаправленностью.
неоколлагенеза в дермі
Люмінера
препарати Радіесс
філллер
кристали гідроксиапатиту
1. Beer K., John M., Cohen J. Evaluation of injectable CaHA for the treatment of mide-face volume loss // J. Drugs Dermatol. - 2008. - V. 7 (4). - P. 359-366.
2. Berlin A., Hussan M., Goldberg D. Calcium hydroxylapatite filler for facial rejuvenation: a histologic and immunohistochemical analysis // Dermatol. Surg. - 2008. - Vol. 34. - P. 64-67.
3. Busso M., Moers-Carpi M., Storck R., Ogilvie P., Ogilvie A. Multicenter, randomized trial assessing the effectiveness and safety of calcium hydroxylapatite for hand rejuvenation // Dermatol. Surg. - 2010. - V. 36. - P. 790-797.
4. Coleman K., Voigts R., De Vore D. et al. Neocollagenesis after injection of Calcium Hydroxylapatite composition in a canine model // Dermatol. Surg. - 2008. - V. 34. - P. 553-555.
5. Jacovella P. Use ofcalcium hidroxylapatite (Radiesse) for facial augmentation. Clinical interventions in Aging. - 2008. - P. 161-174; Hevia O. Correction of lowerface with calcium hydroxylapatite // Dermatol. Surg. - 2009. - V. 35. - P. 1487-1494.
6. Lizzul P., Narurkar V. The role of calcium hidroxylapatite (Radiesse) in nonsurgical aesthetic rejuvenation // J. Drugs Dermatol. - 2010. - V. 9 (5). - P. 446-450.
7. Marmur E., Phelps R., Goldberg D. Clinical, histologic and electron microscopic findings after injection of a calciumhydroxylapatite filler // J. Cosmet Laser Ther. - 2004. - V. 6. - P. 223-226.
8. Pearce A. Histochemistry. Theoretical and applied. - London, 1968. - 561 p.
9. Sundaram H., Voigts R., Beer K., Meland M. Comparison of the rheological properties of viscosity and elasticity in two categories of soft tissue fillers: calcium hydroxylapatite and hyaluronic acid // Dermatol. Surg. - 2010. - V. 36. - P. 1859-1865.
Серед різноманітних патогенетичних трансформацій шкіри в процесі її старіння провідними слід визнати зміни, що зачіпають матрикс дерми [1; 2]. При цьому порушення поліморфні: з одного боку - це зміни водного балансу шкіри і, як результат, зниження рівня вмісту гіалуронової кислоти, з іншого - зниження метаболічних процесів в шкірі і, отже, пригнічення синтезу колагену і еластину [7; 9], і нарешті ефект накопичення вільних радикалів з пошкодженням стінок кровоносних судин і трансендотеліальную транспорту. Використовувані в косметології філери мають на меті зміну обміну метаболітів, відновлення гідродинамічного ефекту, стимуляцію проліферації фібробластів і продукцію ними колагену [4-6]. Найбільший інтерес в аспекті перетворення екстрацелюлярного матриксу дерми представляють філери, до складу яких входять кристали гідроксиапатиту. При цьому, за даними літератури, найбільш активно використовуються в косметології є препарат Радіесс [2; 3; 5], він характеризується як ефективний субдермальних ін'єкційний імплант, головним елементом якого є кальцій гідроксиапатит. Щодо механізму його дії ведуться дискусії, але однозначно, що мова йде про процес активації неоколлагенеза в результаті впливу на фібробласти (шляхом розтягування або деструкції клітин) на тлі зростання продукції цитокінів [4].
Метою даного дослідження є порівняльне вивчення морфологічних змін, що відбуваються в дермі у відповідь на введення різних філерів в ранні (2 тижні) терміни після ін'єкції.
Матеріал і методи. Для порівняння морфологічних перетворень в зоні дерми в якості філерів нами були використані препарати Радіесс (Merz) і Люмінера (Ізраїль). Об'єктом дослідження послужили безпородні щури-самці вагою 200-250 г (25 особин). Препарат вводили субдермальних в обсязі 0,05 мл в задню частину шиї (загривок) всім експериментальним тваринам одночасно. Групі інтактних тварин (контроль) вводили стерильний фізіологічний розчин в тій же дозі. Оцінку результатів проводили через 2 тижні. Для морфологічного вивчення використовували шматочки шкіри з закладенням матеріалу в парафін і забарвлення отриманих зрізів гематоксиліном і еозином. Для виявлення колагенових волокон використані забарвлення по Ван-Гизону, а також забарвлення по Маллорі і Массон (Pears, 1969). З метою типування фібрилярних структур дерми нами була використана забарвлення ПІКРИТ-Сиріусом червоним по Dayan et al (1989). При цьому в поляризованому світлі світіння в спектрі від жовтого до червоного кольору дає колаген I типу. Колаген III типу, яка формує ретикулярні волокна, дає світіння зеленого відтінку. Чим товщі колагенові волокна, тим більше зсув кольору поляризації від зеленого через жовтий в сторону червоного. Для виборчого виявлення ДНК використовували реакцію Фельгена (Pears, 1969). Отримані мікропрепарати піддавали комп'ютерної морфометрії з використанням стандартизованих мікрофотографій в форматі TIF, отриманих з цифрової камери для мікроскопії DCM 310. Аналіз отриманих зображень проводили за допомогою комп'ютерної програми Scion Image фірми Scion Corporation, сертифікованої 2000 року National Institute of Heals (USA). Виміру піддавали діаметри ядер клітин дерми, обсяг аморфного і волокнистого компонентів, а також оптичну щільність ядер. Діаметри ядер використовували для розрахунку індексу ядерної симетрії. Всі цифрові дані піддавалися статистичній обробці з використанням програми Microsoft Excel.
Отримані результати та їх обговорення. Порівняльне вивчення мікропрепаратів з ділянок дерми в зонах введення філерів в термін, відповідний 2 тижнях після ін'єкції, показало наявність ефекту альтерації, зумовленої об'ємом введеного філлера. В мікропрепаратах на цих ділянках зберігаються розірвані колагенові волокна, в кровоносних судинах спостерігається явище стаза, місцями видно вогнища ангіогенезу. У зоні дерми з ін'єктувати препаратом «Радіесс» при фарбуванні гематоксиліном і еозином тіпірующіх темні гранули - це мікросфери, між якими розташовані тонкі неупорядоченно орієнтовані волокна, які по товщині і структурної організації відповідають колагеновим антифібриляторних (рис. 1).
Мал. 1. Мікросфери препарату «Радіесс». Забарвлення гематоксиліном і еозином. Про. 10х, Ок. 10х.
При вивченні самих мікросфер видно, що на їх поверхні розташовуються сплощені, що нагадують фібробласти клітини, розташовані в один ряд (рис. 2). Изредко зустрічаються клітини з двома-трьома ядрами. На тих ділянках, де вміст мікросфер відсутня при фарбуванні по Массон і Маллорі, чітко видно порожнини, стінки яких обмежені дуже тонкими фибриллами (рис. 3).
Мал. 2. Мікросфери препарату «Радіесс». Забарвлення гематоксиліном і еозином. Про. 40х. Ок. 10х.
Мал. 3. Зона ін'єкції препарату «Радіесс». Забарвлення по Массон. Про. 40х. Ок. 10х.
В умовах забарвлення ПІКРИТ-Сиріусом червоним виявилося, що ці фібрили в поляризаційному світлі мають ефект анізотропії, при цьому навколишні стінку капсули фібрили виявляють червоне свічення (колаген 1 типу), фібрили жовтого і зеленого кольорів (колаген III) зустрічаються тут у вигляді вкраплень, що створюють картину «штрихів». Навколо зони ін'єкції філлера найчастіше зустрічаються фібрили, пофарбовані в червоний колір (рис. 4). При оцінці обсягу фибриллярного і аморфного компонентів виявилося, що кількість фибриллярного компонента в середньому становить 33,7 + 1,5 ум. од. (18,3 + 0,6 в контролі), тобто збільшується майже вдвічі. Обсяг аморфного компонента по відношенню до контролю (28,6 + 0,6), навпаки, знижується до 20,1 + 1,9 (табл. 1). Цитогенной строма навколо мікросфер полиморфна. Ми провели комп'ютерну морфометрію ядер клітин в двох зонах локалізації - клітин, що оточують мікросфери, і клітин, що знаходяться в складі тяжів. Виявилося, що рівень середньої оптичної щільності ядер навколо мікросфер складає 132 + 2,28, і цей показник був вище, ніж в ядрах клітин в складі тяжів (табл. 1), і ці відмінності статистично достовірні.
Мал. 4. Мікросфери препарату «Радіесс». Забарвлення ПІКРИТ-Сиріусом червоним. Поляризаційна мікроскопія. Про. 40х. Ок. 10х.
Індекс ядерної симетрії для клітин навколо мікросфер в 2 рази перевищував діаметр ядер клітин в складі строми. Загальний обсяг ядерної маси в порівнянні з рівнем контролю знижується. Однак частка гіперхромних і гіпохромних ядер змінюється; так, число перших знижується, а останніх збільшується (19,8 + 0,07). Не виключено, що ми маємо справу з ефектом еухроматінізаціі і, отже, підвищенням функціональної активності ДНК цих ядер. При вивченні мікропрепаратів, в забарвленні гематоксиліном і еозином, в зоні ін'єкції люмінери через 2 тижні видно, що навколо мікросфер, багато з яких позбавлені вмісту, з'являється велика кількість клітин, які розташовуються неупорядоченно. Особливо чітко вдається розглянути стінку мікросфер, які містять кристали гідроксиапатиту, при цьому видно, що вона утворена колагеновими фибриллами, назовні від яких розташовуються фіброціти (рис. 5). При фарбуванні цих мікросфер ПІКРИТ-Сиріусом червоним з подальшою поляризационной мікроскопією видно, що волокна усередині мікросфер пофарбовані в червоний колір і розташовуються ієрархічно, серед них у вигляді включень тіпірующіх короткі фібрили жовто-зеленого кольору (колаген III типу) (рис. 6). При морфометрії обсягу волокнистого і аморфного компонентів виявилося, що в середньому він становить 17,0 + 3,3 і 28,9 + 1,23 відповідно і не відрізняється від контролю (р> 0,05). Обсяг ядерної маси в порівнянні з вихідним практично не змінюється. Статус хроматину ядер клітин, располо-дені навколо мікросфер і між ними, різниться. При цьому найбільша оптична щільність хроматину характерна для ядер клітин, розташованих навколо мікросфер з люмінерой, що вказує на більшу активність ДНК, значне число молекул якої виявляється чутливою до гідролізу, використовуваному в реакції Фельгена.
Мал. 5. Зона ін'єкції препарату «Люмінера». Забарвлення гематоксиліном і еозином. Про. 40х. Ок. 10х.
Співвідношення гіпохромних і гіперхромних ядер після ін'єкції люмінери характеризується тенденцією до збільшення гіпохромних ядер, але статистично ці відмінності не достовірні. Найбільш вираженим ефектом для препарату «Люмінера» є збільшення оптичної щільності ядер в забарвленні їх реакцією Фельгена. Так, виявилося, що оптична щільність ядер клітин навколо мікросфер з люмінерой збільшується до 153,83 + 1,5 (в контролі 127,33 + 4,35 ум. Од.). При фарбуванні за Ван-Гизону і при реакції Массона колагенові волокна дерми представляються досить широкими, щільно упакованими, і межа між сосочкові і сітчастим шарами дерми нівелюється. На окремих ділянках видно збільшення обсягу аморфного матриксу, і тут колагенові волокна представляються пухко упакованими. Обсяг ядерної маси відповідає рівню контролю, не змінюється і співвідношення площі, зайнятої гіперхромними і гіпохромними ядрами. Разом з тим рівень ентропії колагенових волокон досить низький - це 2,9 + 0,03 ум. од., що вказує на впорядковане розташування фібрил.
Таким чином, отримані дані показують, що в разі використання філерів, що містять кристали гідроксиапатиту, реакція дерми на їх введення різниться. Так, у разі використання препарату «Радіесс» через 2 тижні після ін'єкції спостерігається феномен активації процесу колагенових фібрил, однак позаклітинний процес фибриллогенеза не закінчується на цей термін, і формування типових колагенових волокон не відбувається. Доказом активності процесу фибриллогенеза служить показник збільшення обсягу волокнистого компонента в складі екстрацелюлярного матриксу дерми, який в разі в порівнянні з контролем збільшується в 2 рази. Мікросфери препарату «Радіесс» окружаются фибробластами, причому це вдається спостерігати в окремих мікросфер, вже не оточених субстратом-носієм, і ці клітини реагують на філлер синтезом фібрил, які можуть формувати навколо окремих мікросфер волокнисту оболонку.
Таблиця 1
Морфометрія компонентів дерми через два тижні після введення філлера
індуктор
ядерна
маса
Волокна-Стий
компонент
Аморфний-ний
компонент
Гіперхром-ні
ядра
Гіпохром-ні
ядра
рівень
ентропії
контроль
26,8 + 1,15
18,3 + 0,6
28,6 + 0,6
12,6 + 0,6
14,2 + 0,06
2,7 + 0,06
Радіесс
20,7 + 1,8 Р <0,05
33,7 + 1,5 Р <0,001
20,1 + 1,9
Р <0,01
5,7 + 0,4
Р <0,001
19,8 + 0,07
Р <0,001
3,1 + 0,13
Р <0,05
Люмінера
27,9 + 2,5
Р> 0,05
17,0 + 3,3
Р> 0,05
28,9 + 1,23
Р> 0,05
10,0 + 1,3
Р> 0,05
16,2 + 1,8
Р> 0,05
3,1 + 0,03
Р <0,001
Примітка. Р - відміну від контролю.
Мал. 6. Мікросфери препарату «Люмінера». Забарвлення ПІКРИТ-Сиріусом червоним. Поляризаційна мікроскопія. Про. 40х. Ок. 10х.
Доказом можливої функціональної активності цих клітин може служити збільшення показника оптичної щільності ядер клітин, що оточують мікросфери при реакції Фельгена, вибірково виявляє ДНК, а також збільшення загального обсягу гіпохромних ядер, також проявляють ефекти еухроматінізаціі. До цього терміну процес неоколлагенеза не надто активний і з'являються поза мікросфер волокна при дослідженні в поляризованому світлі містять колаген 1 і колаген Ш типів. Фібробласти, що сформували тонкі фібрили навколо мікросфер, залишаються тут же і трансформуються в фіброціти. Процес неоколлагенеза зміщується за межі зони локалізації мікросфер, але процес позаклітинного фибриллогенеза навіть тут не завершується.
У разі використання препарату «Люмінера» у порівнянні з препаратом «Радіесс» відбувається збільшення в зоні дерми обсягу аморфного матриксу (в 1,5 рази), що наближає його до ефекту індуктивного впливу на дерму гіалуронової кислоти. Звертає увагу той факт, що при введенні люмінери відбувається значне збільшення оптичної щільності ядер клітин навколо мікросфер, і це збільшення статистично значимо як для контролю, так і щодо аналогічного показника для препарату «Радіесс». Цікаво, що збільшення оптичної щільності супроводжується зниженням коефіцієнта співвідношення діаметрів ядер, який становить 1,71 + 0,1 (замість 2,23 + 0,11 контролю).
рецензенти:
Каде А Х., д.м.н., професор, завідувач кафедри загальної та клінічної патфізіології ГБОУ ВПО «КубГМУ» МОЗ України, м Краснодар;
Алексанянц Г.Д., д.м.н., професор, проректор з науково-дослідної роботи ФГБОУ ВПО «КГУФКСТ», м Краснодар.
бібліографічна посилання
Могильна Г.М., Фомічова Є.В., Терехов А.Я., Блатт Ю.Є. ДИНАМІКА КОМПОНЕНТІВ дерми У ВІДПОВІДЬ НА ВСТУП Філер // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2015. - № 4 .;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=21161 (дата звернення: 05.07.2019).
Пропонуємо вашій увазі журнали, що видаються у видавництві «Академія природознавства»
(Високий імпакт-фактор РИНЦ, тематика журналів охоплює всі наукові напрямки)
Ru/ru/article/view?