Методи прижиттєвої лабораторної діагностики гельмінтозів:
- гельмінтокопрологіческіе дослідження;
- гельмінтоовоскопіческіе дослідження;
- гельмінтоларвоскопіческіе дослідження;
- імунобіологічна діагностика;
- діагностична дегельмінтизація і інші методи;
Методи посмертної діагностики:
- патологоанатомічні дослідження;
- повні і неповні гельмінтологічні розтину органів і тканин (ПГВ і НПГВ).
Перш ніж перейти перерахованих вище питань даної теми, вважаю доречним дати визначення поняття «інвазія» і «інвазійні хвороби».
Отже, «інвазія» (від лат. Invasio - напад, вторгнення) - це зараження людини, тваринного і рослин паразитами тваринного походження. Нерідко її ототожнюють з поняттям «инвазионная хвороба», для виникнення якої, крім збудника необхідні наступні умови: сприйнятливість зараженого тваринного, вірулентність збудника, відповідний вплив зовнішнього середовища в період розвитку паразита і ін.
Інвазійні хвороби можуть протікати як в клінічно вираженій формі зі значною смертністю, так і в прихованій (латентній) формі.
Залежно від виду збудника инвазионного захворювання розрізняють: протозоози (викликаються найпростішими), гельмінтози (паразитичними черв'яками - Scolecidae), арахнози (викликані павукоподібними, в тому числі кліщами) і ентомози (викликаються комахами).
В діагностиці інвазійних хвороб вирішальне значення мають лабораторні дослідження, в результаті яких встановлюється збудник.
Розглянемо методи прижиттєвої діагностики гельмінтозів. Для цього використовують як макро-, так і мікроскопічні дослідження, перш за все фекалій, сечі, крові ,, дерми, вмісту порожнин організму і ін. Ці методи гельмінтів-діагностичних досліджень, спрямовані на пошук і вивчення самих гельмінтів, їх фрагментів Іллі яєць і личинок найбільш доказові і широко застосовуються для діагностики гельмінтозів.
Матеріал для діагностичних досліджень повинен бути вільний від будь-яких сторонніх домішок і забруднень, фекалії рекомендується брати з прямої кишки тварини, вони повинні бути свіжими, їх слід тримати на холоді (НЕ> 5оС), можна також консервувати 5-10% розчином формаліну або карболової кислоти .
Гельмінтоскопія - застосовується для виявлення в фекаліях цілих екземплярів гельмінтів або їх фрагментів, особливо при дослідженні на цестодози кишечника. Цей метод використовується також для контролю ефективності проведеної дегельмінтизації, для обліку кількості вигнаних гельмінтів. Для цих досліджень необхідно брати всю одноразову порцію фекалій, а з метою обліку ефективності дегельмінтизації слід збирати всі екскременти, виділені тваринам протягом 2-4 діб після обробки. Зібрані фекалії попередньо оглядають неозброєним оком. Потім їх поміщають в металевий посуд, розбавляють 5-10 кратним кількістю води, перемішують і дають деякий час відстоятися, потім верхній шар зливають (до осаду) і знову додають воду. Ці маніпуляції послідовного промивання і відстоювання проробляють кілька разів. Отриманий осад невеликими порціями досліджують в кюветку (чашках Петрі) на білому і чорному тлі. Всіх видимих гельмінтів вибирають голкою і досліджують під мікроскопом, встановлюючи вид.
Гельмінтоовоскопії - це методи діагностики гельмінтозів в результаті виявлення в матеріалі яєць гельмінтів. Для проведення таких досліджень застосовують наступне обладнання та засоби: мікроскоп біологічний, предметні скла, чашки Петрі, склянки скляні або пластмасові (діаметром не> 4-5 см), мензурки об'ємом 50 мл, фільтраційні ситечка (з капроновою сіткою, панчішної), скляні палички , металеві петлі з діаметром кільця 8-10 мм.
Для діагностичних досліджень використовують флотаційні розчини. Найкращою флотаційного здатністю володіють розчини при температурі 20-22оС. Щільність розчину уточнюємо денсиметром. Насичений розчин технічної селітри або амонію нітрату з щільністю 1,32 (1500 г на 1 літр окропу); натрієвої селітри або натрію нітрату з щільністю 1,38 (співвідношення солі і гарячої води 1: 1); магнію сульфату (сірчанокисла магнезія) з щільністю 1,26-1,28 (920 г на 1 літр гарячої води); натрію тіосульфату або гіпосульфіту натрію, щільністю 1,38-1,40 (+1750 г на 1 літр окропу); сульфат цинку щільністю 1,24 (400 г на 1 літр води); кухонна сіль, щільністю 1,2 (400 г солі в 1 літрі води нагрівають до кипіння), застосовують в холодному стані.
Найпростіший метод гельмінтоовоскопіческого дослідження фекалій - це метод нативного мазка. Невеликий шматочок фекалій поміщають на предметне скло, додають 2-3 краплі суміші рівних частин гліцерину і води, ретельно змішують, покривають покривним склом і дивляться під мікроскопом. Цей метод ненадійний, тому що при слабкій інвазії дає негативний результат.
Метод послідовного промивання (метод осадження, седиментації) застосовують для діагностики трематодозов тварин, яйця збудників яких мають велику питому вагу і не уловлюються методом спливання (флотації). Беруть 5 г фекалій, змішують з 10 кратним кількістю води, фільтрують через сито або марлю і фільтрат відстоюють 5 хвилин. Далі рідина зливають, а до осаду додають чисту воду і знову відстоюють 5 хвилин. До тих пір поки рідина не стане прозорою. Рідину зливають, а осад досліджують під мікроскопом на наявність трематод.
Для діагностики нематодозів і цестодозов найчастіше використовують флотаційні методи. Найбільш поширений і найчастіше вживаний - метод Фюллеборна. Для цього беруть 10-20 г фекалій, поміщають його в банку або склянку ємністю 100-200 мл, ретельно розтирають скляною або дерев'яною паличкою в насиченому розчині кухонної солі. Загальна кількість доданого розчину повинно бути приблизно в 20 разів більше кількості фекалій. Потім фільтруємо і залишаємо на 30 хвилин. З поверхні відстояною рідини металевої петлею знімаємо плівку і переносимо її на предметне скло, покриваємо покривним склом і досліджуємо під мікроскопом. Метод Щербовічу використовують для виявлення яєць з більш високою щільністю (наприклад, яйця метастронгілід), для чого використовують насичений розчин сульфату магнію. Пробу фекалій (3-5 г) розмішують у воді до одержання рівномірної суспензії. Фільтруємо через ситечко в центрифужную пробірку і Центріфугіруем 1-2 хвилини. Верхній шар зливають, а до осаду додають насичений розчин сульфату магнію, добре розмішуємо і знову Центріфугіруем 1-2 хвилини. Потім металевою петлею знімають верхню плівку, поміщають її на предметне скло, накривають покривним і досліджуємо під мікроскопом.
Метод Котельникова і Хренова. Пробу фекалій (3 г) кладуть у склянку і заливають невеликою кількістю насиченого розчину аміачної селітри, розмішуємо скляній (дерев'яної) паличкою і додаємо розчин до 50 мл. Суспензія фільтруємо в іншу склянку і залишаємо на 10-15 хвилин. Знімаємо петлею 3-4 краплі з поверхні, переносимо їх на предметне скло і мікроскопіруем під малим збільшенням мікроскопа. Виявляємо яйця аскарид, трихоцефал, езофагіт, стронгілоідесов, метастронгілід, неоаскарід, стронгілят органів травлення, моніезій і тізаніезій, параскарід, токсокарісов і ін.
Метод Н.В. Демидова для діагностики фасциолеза. Пробу фекалій (3г від овець, 5 г від великої рогатої худоби), поміщають в стакан, наливають насичений розчин хлористого натрію, ретельно розмішуємо скляною паличкою, відстоюють 15-20 хвилин. З поверхні видаляють великі частинки; рідина відсмоктують спринцовкой, або обережно зливають, залишають приблизно 20-30 мл, до осаду додають воду до повного об'єму склянки, ретельно розмішують, фільтрують через сито або 1 шар марлі; рідина знову відсисаємо, залишаючи 15-20 мл осаду; осад переливають в маленькі конічні склянки, відстоюємо 3-5 хвилин, рідина відсисаємо і на предметне скло переносимо осад, досліджуючи його під малим збільшенням мікроскопа.
Метод Дарлінга комбінує процедури осадження і флотації. Фекалій змішують з водою і центрифугують 3-5 хвилин. Надосадову рідину зливають, а до осаду додають рідина Дарлінга (гліцерин з насиченим розчином хлористого натрію, 1: 1), ретельно розмішують і вдруге центрифугируют 3-5 хвилин. Металевої петлею знімаємо плівку на предметне скло, накриваємо покривним і досліджують.
Є ще багато модифікованих методів дослідження з метою виявлення яєць гельмінтів. Існують стандартизовані методи Фюллеборна, Щербовічу і ін. При всіх дослідженнях беруть однакову посуд, один і той же час відстоюють і центрифугують проби, користуються петлями однакового діаметра і, порівнюючи число яєць в поле зору мікроскопа або в одній краплі поверхневої плівки до і після обробки тварин , судять про ефективність проведеної дегельмінтизації. Найбільш простий і досить точною є методика, запропонована М.Ш.Акбаевим з використанням сітки, виготовленої з фотоплівки після рентгенівських знімків. Крім того, використовуються кількісні гельмінтоовоскопіческіе дослідження.
Метод Столу. У 100 мл колбу наливають спочатку 56 мл води і відзначають зовні на рівні її меніска. Потім наливають ще 4 мл води і роблять нову позначку. Воду виливають, а в градуйовану колбу наливають 56 мл 0,1 н розчину їдкого натру, додають стільки фекалій, щоб рівень рідини досяг позначки 60 мл. (4 см3 фекалій), всипають 10-15 бусинок, ретельно збовтують. Відразу ж після збовтування градуйованою піпеткою набирають 0,075 мл або 0,1 мл суміші, наносять на предметне скло і досліджують під мікроскопом, підраховуючи число яєць гельмінтів. Кількість яєць в 1 см3 (1 г) фекалій, знайдене число яєць множать на 200 (якщо досліджували 0,075 мл суміші) або на 150 (якщо 0,1 мл суміші).
Гельмінтоларвоскопіческіе дослідження застосовуються для діагностики діктіокаулез, мюллеріоза і ін. Протостронгілідозов, а також стронгілятози травного тракту жуйних і Стронгілоїдоз різних тварин.
Метод Бермана і Орлова. 10 г фекалій поміщають в воронки апарату Бермана на металевій сітці або загорнуті в шматочки марлі. Заливають водою кімнатної температури і залишають на 3-6 годин. За цей час личинки виповзають з проби в рідину і опускаються по трубці на дно пробірки. Рідина з пробірки зливають і відсмоктують. Осад після струшування розливають на предметне скло і проводять мікроскопію при малому збільшенні мікроскопа. Личинки нематод рухливі і легко виявляються.
Спрощена модифікація методу Бермана (за Шільнікова). У склянку з водою кладуть проби фекалій і загорнуті в марлеві серветки. Через 3-6 годин проби виймають, рідину відстоюють 10-15 хвилин, потім піпеткою відсмоктують прозорий шар води. Потім краплю осаду піпеткою наносять на предметне скло для мікроскопії.
Метод седиментації з центрифугуванням. (Експрес-методика по Котельникова та ін.). 3-5 г фекалій кладуть в пробірки з водою (20-25оС) і центрифугують (1000-1500 оборотів в хвилину) 2 хвилини. Потім воду зливаємо, а осад, струснувши, виливають на предметне скло і досліджують на наявність личинок.
Метод Вайда. На предметне або годинне скло кладуть кілька кульок фекалій від овець, кіз і додають води температурою 40 ° С. Через 4о хвилин кульки видаляють і досліджують під мікроскопом рідина, що залишилася на склі на наявність личинок нематод. Виявлених різними методами личинок необхідно диференціювати.
Дослідження крові по Куликову. З яремної вени набирають 20 мл крові і додають 2 мл 3,8% водного розчину лимонно-кислого натрію і відстоюють протягом 20-25 хвилин. Утворюється 3 шари: нижній - осіли еритроцити, середній - лейкоцити і личинки нематод і верхній - сироватка. Тонкої піпеткою, беруть вміст середнього шару, наносять його краплями на предметне скло, накривають покривним і дивляться під мікроскопом.
Дослідження крові великої рогатої худоби (по Стюардові). Шкіру звільняємо від волосся, місце дезінфікуємо. Пінцетом відтягаємо шкіру і кривими ножицями відрізають поверхневий шар. Поміщають на предметне скло в краплю фізрозчину і ретельно розщеплюють препаровальной голками. Рідина досліджують під мікроскопом.
Дослідження шкіри коней по Р.С.Чеботарёву. На холці, плечі, інших місцях вибирають ділянку шкіри розміром 5 см2, дезінфікуємо спиртом. Захоплюємо шкіру в складку, відрізаємо шматочок товщиною 3-4 мм і площею 2-3 см2. Зрізи поміщають в пробірці і заливають 2-3 мл фізрозчину і залишають на кілька годин в термостаті при 36-37оС або при кімнатній температурі. Потім вміст пробірки виливаємо на годинне скло і досліджують під мікроскопом, з метою виявлення личинок онхоцерков.
Імунобіологічна діагностика. У практиці використовують алергічні реакції для діагностики тканинних гельмінтозів або, так званих, ларвальних цестодозов, таких як ехінококоз, ценуроз, цистіцеркози, а також нематодозов як трихінельоз. Для цього застосовують внутрішньошкірну пробу. В якості антигену рекомендують рідина з личинок (бульбашок) або екстракти з трихінел і їх личинок.
В даний час велику увагу приділяють розробці та використанню серологічних реакцій, використовуючи в якості антигенів живих личинок гельмінтів. За цим принципом ставлять реакції мікропреципітації на живих личинках нематод при нематодозах, на церкариев - при трематодозах, на онкосфера і Сколекс - при ларвальних цестодозах. Інший принцип серологічних реакцій пов'язаний з використанням соматичних антигенів. Застосовують реакції гемаглютинації і флоккуляции (аглютинації) з адсорбованими антигенами. Як адсорбенти використовують кармін, бентоніт і латекссінтетіческая смола.
Різновидом серологічних реакцій є: реакція сколексопреціпітаціі (РСкП), розроблена Р.С.Шульц і Р.Г.Ісмагіловой для діагностики ехінококозу овець. Інші реакції: РНГА, РЗГА та ін.
Діагностична дегельминтизация є методом макрогельмінтоскопі-чеського дослідження. Використовують її при підозрі на монієзіоз, тізанієзіоз, авітелліноз жуйних, аноплоцефалідози коней, теніїдози м'ясоїдних, дрепанідотеніоз водоплавних птахів, аскаридоз свиней, аскарідіоз курей та ін. Невеликій групі тварин; найбільш підозрілих в захворюванні, вводять відповідний антгельмінтик в лікувальної або заниженою дозі. За тваринами спостерігають і перевіряють всі виділені екскременти з метою виявлення гельмінтів або їх фрагментів, які в подальшому досліджують.
І, нарешті, методи дослідження інших органів.
Дослідження сечі: при діоктофімозе нирок, капіляріозу сечового міхура. Сечу слід попередньо переглянути макроскопически або за допомогою лупи на наявність гельмінтів або їх фрагментів. Сечу розбавляють навпіл дистильованою водою і центрифугують 2-3 хвилини, рідину зливають, а осад наносять на предметні скла і досліджують.
Дослідження вмісту трахеї птахів: в ній добре видно сінгамуси або ціатостоми, які зазвичай мають яскраво-червоний колір.
Дослідження вмісту кон'юнктивальних порожнин: прижиттєва діагностика телязиоза великої рогатої худоби (Th. Rhodesi). Дослідник натискає пальцем в області внутрішнього кута ока, потім піднімає пінцетом або векодержателем третє віко. Виявляємо живих і рухомих паразитів. Крім того, можна застосувати іригацію очей великої рогатої худоби з гумовою спринцівки 3-х% розчином борної кислоти. Досліджують випливає в кюветку рідина (телязии).
Дослідження камери очі. Прижиттєва діагностика сетаріоз очей коней і великої рогатої худоби - проводять макроскопічними дослідженням передньої камери ураженого ока, де можна бачити свободноплавающих сетарій (5-10 см) і добре просвічує навіть через помутнілу рогівку.
Дослідження поверхневого зіскрібка з періанальних складок: паличку або сірник, змочену 50% водним розчином гліцерину роблять зіскрібок з періанальних складок з внутрішньої сторони кореня хвоста і з області промежини. Зішкріб переносять на предметне скло в 2-3 краплі гліцерину (1: 1 у воді), покриваємо покривним склом і досліджуємо під мікроскопом на наявність яєць оксіурат.
Методи посмертної діагностики гельмінтозів
- Патологогістологіческое дослідження. Посмертна діагностика гельмінтозів різних стадій їх розвитку в органах і тканинах тварин. Найбільш досконала методика гельминтологического розтину розроблена К.І.Скрябіим. Розрізняють повне і неповне гельмінтологічних розтин.
Повний гельмінтологічних розтин - найбільш надійний метод, що дозволяє виробляти як кількісний, так і якісний облік усіх гельмінтів, якими инвазированной тварина.
Суть даного методу: після зняття з трупа шкіри, ретельно оглядають підшкірну клітковину, потім розкривають грудну і черевну порожнини і витягають всі органи систем: травну, дихальну систему, кровоносну, сечостатеву і ін.
Органи відокремлюють і досліджують окремо, при цьому використовують метод послідовних змивів. Паренхіматозні органи (печінка, легені, підшлункова залоза, нирки та ін.) Поміщають в окремий посуд і перетворюють в фарш, розриваючи руками або розрізаючи на дрібні шматочки ножем або ножицями. Далі цей детрит відмивають водою або фізіологічним розчином, користуючись методом послідовних змивів. Отриманий осад вивчають невеликими порціями спочатку в чорних, а потім в білих кюветах або в чашках Петрі на чорному і білому тлі. Великих гельмінтів вибирають візуально, а дрібних - за допомогою ручної лупи з 8-10-кратним збільшенням. Збирають гельмінтів тільки пензликом або препаровальной голками, але не пінцетом і непальцами.
НПГВ - спрощене гельмінтологічних розтин, в процесі якого витягують з органів і тканин лише окремих різко виділяються за розмірами гельмінтів. Його використовують також для отримання музейного матеріалу.
Гістологічні дослідження проводять з метою вивчення деструктивних змін при окремих паразитозах.
Природно, що це далеко не всі методи лабораторної діагностики паразитозів. Найсучасніші методи засновані на електропровідності тканин організму і гельмінтів; на основі біохімічних процесів, що відбуваються в організмі тварин профілактики інфекційних, інвазійних і незаразних хвороб тварин при впливі тих чи інших паразитів і т.д.
