Визначення инфективности вірусу запасів є першим кроком в MN assay. Малюнок 2 ілюструє структуру пластини для визначення TCID50 запасів вірусу. Для запасів вірусу з невідомим инфективности вірус можна титрують з декількох попередньо розведень, наприклад 10-2 і 10-3, щоб захопити кращі кривої титрування для обчислення инфективности вірусу. Вірус сума використовується в MN assay повинні бути стандартизовані на 100 TCID50 / well (50 мкл). Мінімальна розбавлення запасів вірусу для досягнення 100 TCID50 / добре-1: 100.
Малюнок 3 описує найважливіші кроки пробірного MN, за допомогою MDCK-SIAT1 клітин. Тепло інактивована сірка, серійний розводять в 96-ямковий пластини, як показано на малюнку 4. 100 TCID50 / 50 мкл вірус потім додається до кожної свердловини. Після інкубації 1 h дозволити антитіла в bind сироваток на вірус, 100 мкл 1,5 x 105 клітин / мл MDCK-SIAT1 клітин додаються до кожної свердловини. Для отримання оптимальних результатів MDCK-SIAT1 клітини має бути 75-95% confluency (рис. 1) для TCID50 і MN аналізів. Потім пластини инкубируют на 18-20 год при 37 ° C, 5% CO2. Після ночі інкубації кількість вірусу в кожної свердловини визначається і кількісно протигрипозні NP ELISA (рис. 3).
ОД в кожному добре уявляє кількість вірусної інфекції та реплікацію в клітинах MDCK-SIAT1 в присутності серійно розріджених сірка містить нейтралізуючі антитіла. Це може бути змова проти розведення сироваток (рис. 5). Взаємні високих розведення сироватки, досягнутий ≥50% нейтралізації вважається титр антитіл для зразка сироватки. Малюнок 5 містить приклади результатів від 2 хворих з парних sera випробування проти вірусу A / Гонконг / 4801/2014 A (H3N2) 3C.2a до і після грипу вакцинація. З пацієнта 1 до вакцинації сірка, жоден з розведень сірка пригнічує вірусної інфекції (рис. 5, світло синя крива) і тому вважається негативним (рис. 5, темно синя крива). У порівнянні сироватка від другого пацієнта до вакцинації містить існуючі нейтралізують антитіл на титр 320. Після вакцинації, титр збільшилася до> 1,280. В цьому випадку в 1:10, досягнуті попереднього розбавлення сироватки, немає кінця титр антитіл. Сироватці крові слід знову протестовані на вище попереднього розбавлення для досягнення кінця титр.
Малюнок 1. Культура клітин MDCK-SIAT1. MDCK-SIAT1 клітин. (A) MDCK-SIAT1 вироджена моношару (> 100% confluency) для вірус вакцинації; (B) MDCK-SIAT1 клітин на етапі журналу з 75-95% confluency TCID50 і MN аналізів.
Малюнок 2. TCID пластини макет. Инфективности вірусу визначається TCID50. Вірус фондовій попередньо розбавляють до 10-2, а потім серійно розводили на ½ журналу за розведення до 10-7 (стовпець 1-11), на 8 реплицирует за розведення (рядок A -H). Колонка 12 використовується як тільки осередки. TCID50 акцій вірус може бути розрахована за допомогою методу Рід-Мюнх.
Малюнок 3. Схема аналізу MN, з використанням клітин MDCK-SIAT1. 50 мкл тепла інактивована сірка серійно 2 рази розводили в 96-Уеллс пластини. 50 мкл 100 TCID50 A (H3N2) вірус потім додаються до кожної свердловини. Пластини інкубують при 37 ° C для 1 h дозволити зв'язування вірусу і антитіл. Потім 1,5 х 104 MDCK-SIAT1 клітини додаються до кожної свердловини. Пластини инкубируют на 18-20 год при 37 ° C, 5% CO2. Після ночі інкубації пластини промивають і фіксованою, кількість вірусу в кожній свердловині кількісно, ELISA з використанням моноклональних антитіл проти грипу NP. Титри антитіл сірка розраховуються на основі обрізків визначається вірус і мобільні елементи управління. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Малюнок 4. Макет пластини пробірного MN. Тепло інактивована сірка попередньо розводять в 1:10, потім по черзі секційне розводять в 96-ямковий пластини в колонці 1-10. Вірус (вірус і клітини за все, не сірка) і елементи управління клітини (клітини тільки, не вірус і не сірка) знаходяться в колонці 12. Колонка 11 використовується для задньої титрування або управління сірка. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Малюнок 5. Результати аналізу MN людської сироватки випробування проти вірусу A / Гонконг / 4801/2014 A (H3N2) з використанням клітин MDCK-SIAT1. Сірка з двох пацієнтів перед- і пост-2016-17 сезонного грипу вакцинація були протестовані проти вірусу A / Гонконг / 4801/2014 A (H3N2) за допомогою MDCK-SIAT1 клітин. Нейтралізація титри є взаємні високих розрідження сироватки, яка досягає ≥50% нейтралізації вірусу, як показано стрілками на кожній кривій. Пацієнт 1: попереднє вакцинації титр 1,280.
