1 Стяжкіна С.Н. 1 Пориваева Е.Л. 1 Климентов М.Н. 1 Леднева А.В. 1
1 ФГБОУ ВО «Іжевська державна медична академія»
Імуногістохімічне дослідження використовується для виявлення локалізації антигену в клітинах і тканинах. Albert Coons в 1941 р вперше отримав мічені флюоресцеином антитіла і застосував їх у діагностичних цілях. У 1970 р Ludwig Sternberger винайшов пероксидаза-антіпероксідазний метод [25], а в 1975 р Georges Kцhler і Cйsar Milstein вперше добилися злиття короткоживучих лімфоцитів, які продукують антитіла, і постійно зростаючих клітин плазмоцитоми, і отримані, теоретично «безсмертні», культивовані клони гібридних клітин дозволили отримувати різноманітні моноклональні антитіла в великих кількостях. У 1990-х було виявлено, що можливий пошук нереактивного антигенів в тканинах, фіксованих формаліном і ув'язнених в парафін, шляхом їх нагрівання в буферних розчинах. Це розширило можливості методу і підвищило його чутливість. Метою даного дослідження була оцінка проліферативної активності тканини щитовидної залози за допомогою імуногістохімічних досліджень. Визначення ступеня проліферації дозволяє вибирати найбільш оптимальний обсяг оперативного лікування.
оперативне лікування
імуногістохімія
щитовидна залоза
1. Павлова Т.В. Ультраструктурні і імуногістохімічні особливості раку щитовидної залози / Т.В. Павлова, Е.А. Смирнова // Архів патології. - 2008. - № 3. - С. 49-52.
2. Петров С.В. Керівництво по імуногістохімічної діагностики пухлин людини / Петров С.В., Райхлин Н.Т. - Казань, 2000. - С. 456.
3. Петров С.В. Імуногістохімічна діагностика пухлин щитовидної і паращитовидних залоз, вилочкової залози // Керівництво по імуногістохімічної діагностики пухлин людини / під ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлин. - Казань: Татула, 2004. - С. 150-159.
4. Стяжкіна С.Н., Грачова В.А., Ситников В.А. Клініко-морфологічні паралелі при вузлових утвореннях щитовидної залози // Морфологічні відомості: міжнародний морфологічний журнал. - М. - Берлін, 2009. - С. 217-217.
5. Стяжкіна С.Н., Елгашіна Л.Н., Габібова С.Ф., Максимова Т.А. Виявлення раку щитовидної залози у хворої з вузловим зобом // Збірник важких ситуацій в хірургії. - Іжевськ, 2015. - С. 10.
Імуногістохімія (ІГХ) - це метод виявлення точної локалізації того чи іншого клітинного або тканинного компоненту (антигену) завдяки зв'язуванню його з міченими антитілами. Albert Coons в 1941 р вперше отримав мічені флюоресцеином антитіла і застосував їх у діагностичних цілях. У 1970 р Ludwig Sternberger винайшов пероксидаза-антіпероксідазний метод, а в 1975 р Georges Kцhler і Cйsar Milstein вперше добилися злиття короткоживучих лімфоцитів, які продукують антитіла, і постійно зростаючих клітин плазмоцитоми, і отримані, теоретично «безсмертні», культивовані клони гібридних клітин дозволили отримувати різноманітні моноклональні антитіла в великих кількостях. У 1990-х було виявлено, що можливий пошук нереактивного антигенів в тканинах, фіксованих формаліном і ув'язнених в парафін, шляхом їх нагрівання в буферних розчинах. Це розширило можливості методу і підвищило його чутливість [1].
В останнє десятиліття ІГХ-аналіз знайшов широке застосування в щоденній діагностичної практиці, перестав бути методом суто наукових досліджень.
На сьогоднішній день існують різні імуногістохімічні методи, проте в практичній діяльності найбільш широко поширене непряме іммуноокрашіваніе з використанням біотінавідінового комплексу. Непрямий метод передбачає використання двох різних антитіл.
Первинні антитіла реагують з антигенами тканини. Пов'язані з міткою вторинні антитіла специфічно взаємодіють з первинними, які для вторинних антитіл є антигеном. Метод значно чутливіші прямого, тому що з кожною молекулою первинних антитіл зв'язується кілька молекул вторинних антитіл, що містять мітку. Біотин (вітамін H) - з'єднання, стійке до дії високих температур, до кислої і лужної середовищі, добре розчиняється у воді і спирті. Він є коферментом у багатьох реакціях приєднання (карбоксилювання). Біотин легко може вступати в стійке з'єднання з різними білками, в тому числі з ферментами і імуноглобулінами. Авидин утворює з біотином надзвичайно стійкий комплекс. Зруйнувати такий комплекс можна тільки при температурній обробці, тому що авидин руйнується при нагріванні. Авидин має 4 місця зв'язування, до яких можна приєднати біотин або білки. Таким чином, комплекс біотінавідін використовується сполучною містком між антитілами і ферментами. Для цього готується комплекс, що складається з ферменту, пов'язаного з біотином, і авідіна [2].
В даний час все більшого поширення імуногістохімічне дослідження набуває в дослідженні щитовидної залози. Дане дослідження дозволяє оцінити ступінь проліферативної активності клітин щитовидної залози.
Мета дослідження
Метою роботи було вивчення проліферативної активності тканини щитовидної залози на основі експресії білків Ki67 (клон MIB-1), p53 (клон DO-7), тиреоїдних фактора транскрипції TTF-1 (клон 8G7G3 / 1), тиреоглобуліну (клон DAK-Tg6) і їх взаємозв'язку з можливістю рецидиву зоба після оперативного лікування. Це дозволяє прогнозувати можливість або відсутність рецидиву, допомагає у виборі більш щадить операції.
Матеріали і методи дослідження
Імуногістохімічні реакції проводились на фіксованих 10% -ним фосфатним забуферений формаліном, залитих в парафін зрізах. Використовувалися моноклональні антитіла до білків Ki67 (клон MIB-1), p53 (клон DO-7), тиреоїдних фактору транскрипції TTF-1 (клон 8G7G3 / 1), тиреоглобуліну (клон DAK-Tg6). Для відновлення антигенних детермінант застосовувався метод нагрівання в цитратному буфері при 95 градусах Цельсія протягом 20 хвилин на водяній бані. Використовувалася високочутлива полімерна система детекції, мічена пероксидазою хрону. Як хромогену використовувався діамінобензідін (продукт реакції має різні відтінки коричневого кольору, від жовтуватого до майже чорного, залежно від концентрації антигену в досліджуваній тканині). З метою візуалізації морфології тканини зрізи дофарбовував гематоксилином Майера протягом 30 секунд до слабкої синьо-фіолетового забарвлення ядер клітин. Надалі готові препарати вивчалися за допомогою мікроскопа в прохідному світлі. Діапазон збільшень від 50 до 1000.
У дослідженні було проведено 30 імуногістохімічних досліджень препаратів щитовидної залози, віддалених у пацієнтів хірургічного відділення буз МОЗ «Перша республіканська клінічна лікарня МОЗ УР» м Іжевська з дифузними токсичними і дифузно-вузловими формами зоба в період з 01.02. 2015 р по 01.02.2016 р
Результати дослідження
При дослідженні операційного матеріалу виробляли його розподіл за морфологічними ознаками: дифузний зоб, вузловий зоб, змішаний зоб (включаючи кістозний і кістозно-вузловий).
Таблиця 1
Розподіл зоба за морфологічною будовою
дифузний зоб
вузловий зоб
змішаний зоб
всього
кількість
6
21
3
40
20%
70%
10%
100%
Таблиця 2
Розподіл факторів проліферативної активності у пацієнтів при иммуногистохимическом дослідженні
До 20%
20-55%
Понад 55%
Ki67
18
10
2
60%
33%
7%
До 30%
30-50%
Більше 50%
p53
23
6
1
77%
20%
3%
У пацієнтів з макрофоллікулярнимі формами зоба відзначається низький індекс проліферації фолікулярного епітелію (до 1% позитивних клітин) - експресія Ki67. При мікрофоллікулярних формах зоба відзначається більш високий індекс проліферації фолікулярного епітелію (до 5% позитивних клітин). Білок p53 є проапоптотическим білком, бере участь в одному з основних сигнальних шляхів, що регулюють запрограмовану загибель клітини (апоптоз) - ядерний шлях апоптозу. Він експресується в ядрах більшості нормальних клітин, при цьому визначається ступінь експресії слабка (жовтувате або блідо-коричневе забарвлення ядер) - так званий дикий тип гена. При мутації гена, що кодує білок р53, функція білка порушується, ядерний шлях апоптозу блокується, клітини стають «безсмертними», що може згодом стати основою для розвитку пухлини. Мутантний ген також має властивість гіперекспрессіі - проводиться велика кількість білка р53, що не володіє функціональною активністю. Продукт мутантного гена накопичується в ядрах клітин, що імуногістохімічно виявляється у вигляді темно-коричневого фарбування ядер, більш яскравого, ніж забарвлення ядер сусідніх клітин, які мають ген «дикого» типу (малюнок).
Експресія білка р53 в нормальної тканини щитовидної залози. Слабке жовтувато-коричневе забарвлення ядер на синьо-фіолетовому тлі. «Дикий тип» експресії гена р53
У пацієнтів з проліферативними формами зоба спостерігалося більш інтенсивне коричневе забарвлення ядер, що вказує на гіперекспрессію гена р53 в ділянках мікрофоллікулярной проліферації і побічно свідчить про можливу мутацію гена р53. У 2 пацієнтів спостерігалася гіперекспресія мутантного гена р53 в ділянці мікрофоллікулярной проліферації епітелію з морфологічними (ядерними) ознаками важкої дисплазії, що говорить про високий потенціал пухлинної трансформації цієї клітинної популяції [3].
Тиреоглобулін - білковий продукт фолікулярного епітелію щитовидної залози, що виявляються в цитоплазмі фолікулярнихклітин, в колоїді фолікулів щитовидної залози. Позитивна реакція визначається по різних відтінків коричневого фарбування вищеназваних структур. У пацієнтів з макрофоллікуляним зобом спостерігається помірна інтенсивність реакції в колоїді фолікулів. У пацієнтів з ТИРЕОТОКСИЧЕСКОГО формами зоба спостерігалася інтенсивна реакція в колоїді фолікулів і в цитоплазмі фолікулярного епітелію, що свідчить про високу функціональну активність тканини залози. У пацієнтів з мікрофоллікулярнимі формами зоба структури в цитоплазмі практично не містять колоїду, що говорить про функціональну незрілість даної ділянки залозистої тканини. Тиреоїдний фактор транскрипції TTF-1 - білковий продукт, що локалізується в ядрах клітин фолікулярного епітелію щитовидної залози, С-клітин щитовидної залози, альвеолярного епітелію і нейроендокринних клітин легені. Цей білок є індуктором транскрипції (експресії) груп генів, відповідальних за диференціювання вищеназваних клітинних типів, що мають спільне походження в ембріогенезі. Позитивна реакція визначається по коричневому фарбуванню ядер клітин.
При першій-ліпшій нагоді зоба спостерігалася інтенсивна експресія TTF-1 в фолікулярному епітелії.
Після проведених імуногістохімічних досліджень всі випадки були розподілені в 3 групи відповідно до ступеня виявленої проліферації тканини щитовидної залози [4].
I ступінь проліферації:
- індекс проліферації Ki-67 становить 15-20%;
- експресія протеїну р53 становить 25-30%;
- проліферація фолікулярного і парафоллікулярнимі епітелію, що займають 30-35% фолікулів.
II ступінь проліферації:
- індекс проліферації Ki-67 склав 50-55%;
- експресія протеїну р53 становить 55-60%;
- проліферація фолікулярного і парафоллікулярнимі епітелію, що займають 50% фолікулів.
III ступінь проліферації:
- проліферація фолікулярного і парафоллікулярнимі епітелію, що займають 70-75% фолікулів;
- індекс проліферації Ki-67 склав 70%;
- експресія протеїну р53 75-80%.
Результати дослідження
Після проведених імуногістохімічних досліджень всі випадки були розподілені в 3 групи відповідно до ступеня виявленої проліферації тканини щитовидної залози. У 60% випадків була виявлена I ступінь проліферації, що дозволяє в даних випадках виконувати органозберігаючі операції. У 33% випадках була виявлена II ступінь проліферації тканини щитовидної залози, що може говорити про високий ризик рецидиву, в даному випадку будуть виправдані радикальні операції. У 7% випадків була виявлена III ступінь проліферації, що має на увазі ризик малігнізації, дані пацієнти повинні бути оперовані в умовах онкологічного диспансеру [5].
висновки
Перша ступінь зобної проліферації не є фактором ризику рецидиву зоба після оперативного видалення однієї частки (геміструмектомія) або резекції щитовидної залози. Друга ступінь зобної проліферації служить фактором ризику рецидиву зоба. Третя ступінь проліферації служить достовірною ознакою рецидиву зоба і можливої малігнізації вузлів-регенератов. Ця стадія повинна розглядатися як передракова і оцінюватися як дисплазія III ступеня.
висновок
При виявленні першого ступеня проліферації зоба виправданими були органозберігаючі операції, гемітіреоідектомія або резекція щитовидної залози, оскільки ризик рецидиву відсутня. При виявленні другого ступеня проліферації доцільніше виконувати субтотальную тіреоідектомію, так як існує ризик рецидиву. При виявленні третього ступеня проліферації має проводитися радикальне оперативне лікування в умовах онкологічного диспансеру.
бібліографічна посилання
Стяжкіна С.Н., Пориваева Е.Л., Климентов М.Н., Леднева А.В. МОЖЛИВОСТІ імуногістохімічного дослідження ДЛЯ ОЦІНКИ проліферативної активності ТКАНИНИ щитовидної залози // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2017. - № 2 .;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=26185 (дата звернення: 03.04.2019).
Пропонуємо вашій увазі журнали, що видаються у видавництві «Академія природознавства»
(Високий імпакт-фактор РИНЦ, тематика журналів охоплює всі наукові напрямки)
Ru/ru/article/view?