Оцінка ефективності інтерферону альфа-2b в комбінації з антиоксидантами щодо вірусу грипу птахів A (H7N9) in vitro

1. Матеріали і методи дослідження
2. Результати та обговорення
3. висновки

Відомо, що віруси здатні до фенотипической і генотипической мінливості і постійно формують небезпечні для людської популяції варіанти. Найбільшу проблему з точки зору епідеміології є мінливість вірусів грипу [4]. Одним з механізмів формування нових варіантів вірусу грипу є формування реассоціатов в результаті змішаного зараження. Найбільш частим джерелом утворення нових варіантів вірусу грипу А є водоплавні і інші птахи [1, 4].

На даний момент Всесвітньою організацією охорони здоров'я (ВООЗ) зафіксовано декілька варіантів вірусів грипу птахів, здатних інфікувати людину: штами вірусу грипу птахів А (H5N1) і A (H7N9) [1]. Вперше про зараження грипом птахів A (H7N9) людини було повідомлено 31 березня 2013 року органами охорони здоров'я Китаю, на сьогоднішній день в ВООЗ надійшли повідомлення про 453 лабораторно підтверджених випадків інфікування людей вірусом пташиного грипу A (H7N9), отримані від Національної комісії з охорони здоров'я і планування сім'ї КНР, від Гонконзького Центру з охорони здоров'я і від Центрів контролю захворювань Тайбея [1].

Незважаючи на незначну кількість повідомлень про зараження даним вірусом людини, вірус грипу птахів A (H7N9) викликає у лікарів занепокоєння в зв'язку з тим, що у більшості пацієнтів перебіг захворювання був у тяжкій формі і в 175 випадках мало летальний результат [1]. Таким чином, своєчасне пошук способів лікування даної інфекції є актуальним завданням.

Хіміопрепарати проти вірусу грипу представлені сполуками, які надають свій вплив на різні стадії реплікації вірусу грипу: препарати ремантадина блокують білок М2 вірусу грипу. Препарати занамівір і озельтамівір діють як інгібітори нейрамінідази. Відносно препаратів групи ремантадина можна відзначити їх високу токсичність і низьку ефективність, так як вони активні тільки щодо грипу А, але не проти грипу В. Інгібітори нейрамінідази є ефективними препаратами, але, маючи високу вартість, менш доступні для населення.

В організмі людини основною системою, відповідальною за боротьбу з вірусними інфекціями, є система інтерферону. В арсеналі сучасної медицини є препарати рекомбінантного інтерферону альфа-2b, широкий спектр противірусної активності яких характеризован в численних дослідженнях як in vitro, так і in vivo [5].

За даними різних дослідників ефективність терапії інтерфероном альфа-2b вірусних інфекцій можна значно підвищити за допомогою антиоксидантів [2, 3, 7, 8]. Вперше про синергизме інтерферону альфа-2b та антиоксидантів в терапії вірусних інфекцій повідомлялося в роботах В. В. Малиновської. За даними [7, 8] комбінація інтерферону альфа-2b та антиоксидантів iv vitro і in vivo має виражений синергічний ефект: в присутності антиоксидантів специфічна противірусна активність інтерферону збільшується в кілька разів, що дозволяє не тільки підвищити ефективність терапії, але і знизити можливість прояву побічних ефектів.

Метою цієї роботи було вивчення противірусної активності інтерферону альфа-2b як противірусного препарату по відношенню до вірусу грипу птахів A (H7N9) і оцінка впливу антиоксидантів на перебіг експериментальної інфекції in vitro.

Матеріали і методи дослідження

Культура клітин

Лінія клітин нирки зеленої мавпи Vero клон Е6, отримана з лабораторії культур тканин ФГБУ НДІ вірусології ім. Д. І. Іванівського. Культуру клітин вирощували в вигляді моношару в 96-ямковий планшетах при 37 ° С в атмосфері 5% СО2 з використанням середовища Голка МЕМ з додаванням антибіотиків (100 Од / мл пеніциліну і стрептоміцину 50 МО / мл), глутаміну 150 мкг / мл і 10% сироватки крові ембріонів корів (ростовая середа). В якості підтримуючої використовували середу Голка з додаванням антибіотиків (100 Од / мл пеніциліну і стрептоміцину 50 МО / мл), глутаміну 150 мкг / мл і 2% інактивованої при 56 ° С сироватки крові ембріонів корів.

вірус

Штам вірусу грипу птахів A / Anhui / 2013 (H7N9) отримано з лабораторії Державної колекції вірусів ФГБУ НДІ вірусології ім. Д. І. Іванівського. Для культивування використовували алантоїсну порожнину 9-10-денних курячих ембріонів.

препарати

• Інтерферон альфа-2b людський рекомбінантний, Р N003726 / 01, виробництва ТОВ «Фармапарк», Росія, активність 4 × 108 МО / мл. Має виражену противірусну, антипроліферативну та імуномодулюючу активність. Як референсу активності інтерферону альфа-2b людського рекомбінантного використовували міжнародний стандарт активності інтерферону (International Standard Interferon alpha 2b, NIBSC code: 95/566).
• Аскорбінова кислота (вітамін С), ЛС-000420, виробництва «ДСМ Нутрішнл Продактс (ЮК) Лімітед», Великобританія. Є високоактивним природним антиоксидантом, нейтралізує вільні радикали, має здатність відновлювати активну форму вітаміну Е.
• Аскорбат натрію, ЛС-000423, виробництва «ДСМ Нутрішнл Продактс (ЮК) Лімітед», Великобританія. Є натрієвої сіллю аскорбінової кислоти, має аналогічну біологічну активність з аскорбіновою кислотою, але на відміну від неї має менший поверхневим подразнюють.
• Альфа-токоферолу ацетат (вітамін E), dl-альфа-токоферолу ацетат, тип CWS / F500, водорозчинна форма, виробництва Sigma Aldridsch, США. Є високоактивним природним антиоксидантом і антигіпоксантів, нейтралізує вільні радикали і перекису жирних кислот, активні форми кисню, здатний запобігати перекисне окислення мембран клітин.
• Мексидол (етілметілгідроксіпірідіна сукцинат), P N002161 / 01, виробництва ТОВ «НПК Фармасофт», Росія. Є високоактивним синтетичним антиоксидантом, нейтралізує вільні радикали.

цитотоксичність

Оцінку цитотоксичности препаратів проводили за стандартною методикою [6] шляхом інкубації 1-добового моношару клітинної культури Vero клон Е6 з різними концентраціями препаратів протягом 72 годин в 96-ямковий планшетах при 37 ° С в атмосфері 5% СО2. Після інкубації клітини відмивали розчином Хенкса, для підрахунку кількості клітин використовували автоматичний лічильник клітин Cauntess, виробництва Invitrogen, США із застосуванням 0,4% розчину трипанового синього. За ЦД50 (50% тканинна цитопатичної доза) випробуваного зразка брали максимальну концентрацію, сприяє виживанню не менше 50% клітин в порівнянні з контролем. За МПК (максимально переносима концентрація) випробуваного зразка брали максимальну концентрацію випробуваного зразка, що не викликає видимих ​​змін в життєздатності клітин.

антивірусна активність

Антивірусну активність оцінювали за рівнем придушення цитопатичної дії вірусу різними розведеннями препаратів і комбінацій на культурі клітин Vero клон Е6. Для роботи використовували 1-добовий моношар культури, вирощений в 96-ямковий планшетах. Множинність інфікування вірусу грипу птахів A / Anhui / 2013 (H7N9) склала 0,1 ТЦД50 на клітку, тривалість інкубації 48 годин при 37 ° С в атмосфері 5% СО2. За ІК50 (50% інгібуюча концентрація) брали концентрацію випробуваного зразка, при якій клітинна культура виявилася повністю захищеною від цитопатичної дії вірусу в 50% лунок.

Результати та обговорення

Вивчення цитотоксичної дії препаратів

Певні максимальні переносяться концентрації препаратів, що не роблять цитотоксичної дії на культуру клітин Vero клон Е6, наведені в табл. 1.

Для роботи на культурі клітин при визначенні антивірусної активності використовували концентрації препаратів менше або рівні МПК, зазначені в табл. 1.

Вивчення антивірусної активності препаратів

Певні для препаратів ІК50 щодо вірусу грипу птахів A / Anhui / 2013 (H7N9) представлені в табл. 1. Для оцінки можливої ​​перспективи використання препарату в якості хіміотерапевтичного засобу щодо вірусної інфекції використовували поняття ХТИ (хіміотерапевтичний індекс) - відношення максимально переносної концентрації препарату до ІК50. Для ефективних противірусних препаратів величина ХТИ повинна бути більше 3. Отримані дані щодо антивірусної активності досліджуваних препаратів показують, що інтерферон альфа-2b людський рекомбінантний може бути використаний як засіб противірусної терапії інфекції, спричиненої вірусом грипу птахів A / Anhui / 2013 (H7N9) . Також показано, що антиоксидант Мексидол має слабко противірусну активність зі значенням ХТИ 4,0.

Вивчення антивірусної активності комбінацій препаратів

Для вивчення впливу антиоксидантів на антивірусну активність інтерферону альфа-2b готували розчини досліджуваних препаратів з різною концентрацією як інтерферону альфа-2b, так і антиоксидантів. Для оцінки ефективності комбінації використовували поняття фракційного ингибирующего коефіцієнта (ФВК), значення якого обчислювали за формулою (ІД50 - 50% інгібуюча доза):

При значенні ФИК 0,5 має місце помірний синергізм з'єднань, при значенні ФИК, рівному 1,0-1,5, має місце адитивний ефект комбінації, при значенні ФИК більше 2 має місце антагонізм з'єднань [9]. Результати оцінки впливу антиоксидантів на антивірусну активність інтерферону альфа-2b наведені в табл. 2.

З представлених даних видно, що антиоксиданти надають стимулюючу дію на противірусну активність інтерферону альфа-2b: в присутності різних концентрацій антиоксидантів ІК50 інтерферону альфа-2b знижується в 2 і більше разів. Так, наприклад, в присутності аскорбінової кислоти в концентрації 25 мкг / мл ІК50 інтерферону альфа-2b знижується в 8 разів, при використанні концентрації 2,5 мкг / мл - в 2 рази. У присутності аскорбата натрію в концентрації 25 мкг / мл ІК50 інтерферону альфа-2b знижується в 8 разів, при використанні концентрації 2,5 мкг / мл - в 4 рази. При використанні альфа-токоферолу ацетату в концентрації 25 мкг / мл і 2,5 мкг / мл ІК50 інтерферону альфа-2b знижується в 8 разів. При спільному використанні з мексидола в концентрації 25 мкг / мл ІК50 інтерферону альфа-2b знижується в 8 разів, при використанні в концентрації 2,5 мкг / мл - в 4 рази.

При аналізі ефекту комбінованого застосування антиоксидантів і інтерферону альфа-2b шляхом розрахунку ФИК отримані дані, що демонструють явно виражений синергічний ефект для всіх комбінацій, причому максимальний синергічний ефект спостерігали при комбінуванні з альфа-токоферолу ацетатом. Трохи менш виражений синергічний ефект спостерігали при спільному застосуванні інтерферону альфа-2b та аскорбінової кислоти, найменш виражений синергізм спостерігали для комбінації інтерферону альфа-2b та мексидола.

висновки

Інтерферон альфа-2b людський рекомбінантний є ефективним препаратом у відношенні вірусу грипу птахів A / Anhui / 2013 (H7N9), значення хіміотерапевтичного індексу препарату дорівнює 16. Застосування інтерферону альфа-2b в комбінації з антиоксидантами підвищує його ефективність щодо вірусу грипу птахів A / Anhui / 2013 (H7N9) в 8 разів, до величини хіміотерапевтичного індексу 128.

література

1. Бюлетень ВООЗ «WHO RISK ASSESSMENT. Human infections with avian influenza A (H7N9) virus »від 02.10.2014 р
2. Васильєв А. М. Оцінка впливу антиоксидантів на специфічну противірусну активність інтерферону алфьа-2 b людського рекомбінантного щодо вірусу простого герпесу в культурі клітин // Антибіотики і хіміотерапія. 2010. № 7. С. 20-25.
3. Васильєв А. Н., Дерябін П. Г., галега Г. А. Протвовірусная активність антиоксидантів і їх комбінацій з інтерфероном альфа-2b людських рекомбінантним щодо вірусу грипу птахів А / H5N1 // Цитокіни і запалення. 2011. Т. 10. № 2. С. 32-36.
4. Грип та інші респіраторні вірусні інфекції: епідеміологія, профілактика, діагностика і терапія / За ред. О. І. Кисельова, І. Г. Маринича, А. А. Сомініной. Монографія. СПб, 2003 244 с.
5. Єршов Ф. І., Кисельов О. І. Інтерферони та їх індуктори (від молекул до ліків). М., 2005. 368 с.
6. Керівництво з експериментального (доклінічного) вивчення нових фармакологічних речовин / Под ред. Р. У. Хабрієва. М., 2005.
7. Темічева Е. В., Малиновська В. В., Манахова Л. С. та ін. // Питання вірусології. 1986. № 1. C. 12-18.
8. Темічева Е. В. Інтерферонова статус при рецидивуючому герпесі геніталій і корекція його порушень. Автореф. дис. ... канд. мед. наук. М., 1989.
9. De Clercq E., Sakuma T., Baba M., Pauwels R., Balzarini J., Rosenberg I., Holý A. Antiviral activity of phosphonylmethoxyalkyl derivatives of purine and pyrimidines // Antiviral research. 1987. Vol. 8. № 5-6. Р. 261-272.

П. Г. Дерябін1, доктор медичних наук, професор, академік РАПН
Г. А. галега, доктор медичних наук, професор

ФГБУ ФНІЦЕІМ ім. Н. Ф. Гамалії МОЗ РФ, Москва

1 Контактна інформація: [email protected]

Купити номер з цією статтею в pdf