ОЦІНКА ЕКСПРЕСІЇ ГЕНОВ КАТЕЛІЦІДІНА LL-37 І БЕТА-дефенсин-1, -2, -3 ЛЮДИНИ В слизовій оболонці середнього вуха ПРИ ХРОНІЧНИХ ЗАПАЛЬНИХ ЗАХВОРЮВАННЯХ

1 Тирнове Є.В. 1 Альошина Г.М. 2 Янов Ю.К. 1 Кокряков В.Н. 2

1 ФГБУ «Санкт-Петербурзький науково-дослідний інститут вуха, горла, носа й мови» МОЗ Росії

2 ФГБНУ «Інститут експериментальної медицини»

Методом зворотної транскрипції і полімеразної ланцюгової реакції в режимі реального часу проведена оцінка експресії генів антимікробних пептидів кателіцідіна LL-37 і бета-дефенсин-1, -2, -3 людини (hBD-1, -2, -3) в епітелії слизової оболонки середнього вуха при хронічних запальних захворюваннях (хронічний середній отит, отосклероз) за рівнем синтезу відповідних матричних рибонуклеїнових кислот (мРНК). Досліджували 92 зразка операційного матеріалу: слизова оболонка барабанної і мастоідальной порожнин, суперструктури стремена, нижніх і середніх носових раковин в якості контролю. Частота детекції експресії мРНК hBD-2 в барабанної порожнини при отиті з холестеатомой вище, ніж в контролі і при отосклерозі: відношення шансів (ВШ) 8,80 (95% довірчий інтервал 1,35 ÷ 57,43), тимпаносклероз ОШ = 19, 20 (1,88 ÷ 196,55), в мастоідальной порожнини ОШ = 5,87 (1,08 ÷ 32,00); частота детекції експресії мРНК hBD-3 в барабанної порожнини при отиті з холестеатомой вище, ніж при отосклерозі ОШ = 14,00 (1,39 ÷ 141,49). Експресія мРНК LL-37 детектувати в барабанної порожнини найрідше в порівнянні з контролями при отосклерозі ОШ = 31,15 (1,53 ÷ 633,17) і отиті з холестеатомой ОШ = 23,40 (1,15 ÷ 477,59). Рівні експресії гена LL-37 в епітелії середнього вуха знижені в порівнянні з порожниною носа (p

бета-дефенсин-1 людини (hbd-1)

бета-дефенсин-2 людини

бета-дефенсин-3 людини

кателіцідін ll-37

полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) в режимі реального часу

слизова оболонка середнього вуха

1. Underwood MA, Bevins CL Defensin-barbed innate immunity: clinical associations in the pediatric population // Pediatrics 2010, vol. 125, no. 6, pp. 1237-1247.

2. Lee HY, Takeshita T., Shimada J., Akopyan A., Woo JI, Pan H., Moon SK, Andalibi A., Park RK, Kang SH, Kang SS, Gellibolian R., Lim DJ Induction of beta defensin 2 by NTHi requires TLR2 mediated MyD88 and IRAK-TRAF6-p38MAPK signaling pathway in human middle ear epithelial cells // BMC Infectious Diseases, 2008, vol. 8: 87. - URL: http://www.biomedcentral.com/1471-2334/8/87.

3. McGillivary G., Mason KM, Jurcisek JA, Peeples ME, Bakaletz LO RSV-induced dysregulation of expression of a mucosal beta-defensin augments colonization of the upper airway by non-typeable Haemophilus influenza // Cellular microbiology 2009, vol. 11, no. 9, pp. 1399-1408.

4. McGillivary G., Ray WC, Bevins CL, Munson RS Jr., Bakaletz LO A member of the cathelicidin family of antimicrobial peptides is produced in the upper airway of the chinchilla and its mRNA expression is altered by common viral and bacterial co- pathogens of otitis media // Molecular immunology, 2007, vol. 44, no. 9, pp. 2446-2458.

5. Lee HY, Andalibi A., Webster P., Moon SK, Teufert K., Kang SH, Li JD, Nagura M., Ganz T., Lim DJ Antimicrobial activity of innate immune molecules against Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis and nontypeable Haemophilus influenza // BMC Infectious Diseases, 2004, vol. 4: 12. - URL: http://www.biomedcentral.com/1471-2334/4/12.

6. Li JD, Hermansson A., Ryan AF, Bakaletz LO, Brown SD, Cheeseman MT, Juhn SK, Jung TT, Lim DJ, Lim JH, Lin J., Moon SK, Post JC Panel 4: Recent advances in otitis media in molecular biology, biochemistry, genetics, and animal models // Otolaryngology - head and neck surgery, 2013, vol. 148, suppl. 4, E52-63.

7. Medzhitov R., Schneider DS, Soares MP Disease tolerance as a defense strategy // Science 2012, vol. 335, no. 6071, pp. 936-941.

8. Оцінка експресії генів бета-дефенсин-1 і -2 людини і кателіцідіна LL-37 в слизовій оболонці верхніх дихальних шляхів / Є.В. Тирнове [и др.] // Цитокіни і запалення. - 2014. - Т. 13, № 2. - С. 89-95.

9. Вивчення експресії гена бета-дефенсин-3 людини в слизовій оболонці верхніх дихальних шляхів / Є.В. Тирнове [и др.] // Ріс. оторінолар. - 2015. - № 2 (75). - С.77-84.

10. Jin Shin D., Gan-Undram S., Jin Kim S., Joon Jun Y., Jung Im G., Hyun Jung H. Expression of beta-defensins in the tubotympanum of experimental otitis media // Acta oto-laryngologica , 2006, vol. 126, no. 10, pp. 1040-1045.

11. Meyer JE, Schwaab M., Beier UH, Görögh T., Buchelt T., Frese K., Maune S. Association between human beta defensin expression and cholesteatoma formation // Auris, nasus, larynx, 2006, vol. 33, no. 2, pp. 159-165.

12. Woo JI, Kil SH, Brough DE, Lee YJ, Lim DJ, Moon SK Therapeutic potential of adenovirus-mediated delivery of β-defensin 2 for experimental otitis media // Innate immunity, 2015-го, vol. 21, no. 2, pp. 215-224.

13. Underwood M., Bakaletz L. Innate immunity and the role of defensins in otitis media // Current allergy and asthma reports, 2011, vol. 11, no. 6, pp. 499-507.

14. Wu M., McClellan SA, Barrett RP, Hazlett LD Beta-defensin-2 promotes resistance against infection with P. aeruginosa // Journal of immunology 2009, vol. 182, no. 3, pp.1609-1616.

15. Jones EA, McGillivary G., Bakaletz LO Extracellular DNA within a nontypeable Haemophilus influenzae-induced biofilm binds human beta defensin-3 and reduces its antimicrobial activity // Journal of innate immunity, 2013, vol. 5, no. 1, pp. 24-38.

Ключовим питанням розуміння патофізіології середнього отиту є те, яким чином порожнину середнього вуха, яка безпосередньо контактує з носоглоткою, заселеної мікроорганізмами, включаючи етіологічні агенти середнього отиту, зберігається стерильною у здорових людей [1, 2]. Механізми, що лежать в основі полимикробной природи середнього отиту, не цілком ясні. Проте є свідчення, які вказують на те, що вірус-опосередковані пошкодження епітелію, що вистилає слизову оболонку верхніх дихальних шляхів, зниження мукоциліарногокліренсу і підвищена експресія клітинами організму молекул, які сприяють адгезії бактерій, вносять вклад в патогенез середнього отиту [3].

Систему механізмів природженого імунітету вважають невід'ємною частиною захисту середнього вуха від інфекцій. Респіраторний епітелій слизових оболонок, в тому числі середнього вуха і слухової труби, секретує антимікробні молекули (білки - лізоцим, лактоферин і катіонні пептиди - дефенсин і кателіцідіни). Антимікробні пептиди (бета-дефенсин (hBD), кателіцідін) відіграють основну роль в захисті поверхні слизових від широкого набору мікроорганізмів (грам позитивних та грам бактерій, грибків, найпростіших і оболонкових вірусів), включаючи поєднані вірусні та бактеріальні патогени полімікробна захворювання - середнього отиту, в тому числі хронічного середнього отиту, рецидивуючого середнього отиту і ексудативного середнього отиту [4]. Пептиди володіють прямої і непрямої антимікробну активність, можуть виступати в якості хемокинов, а також індукувати продукцію хемокінів, що приводить до рекрутування лейкоцитів у вогнище інфекції, сприяють загоєнню ран і здатні модулювати адаптивний імунну відповідь.

Тестування клінічних ізолятів респіраторних патогенів середнього отиту виявило бактерицидну активність hBD-2 щодо грамнегативних Moraxella catarrhalis, нетіпіруемие Haemophilus influenzae (NTHi) і грампозитивних Streptococcus pneumoniae, а також бактерицидну активність hBD-1 щодо M. catarrhalis і помірний інгібуючий ефект на зростання S. pneumoniae [5]. Кателіцідін LL-37 і hBD-3 також діють в туботімпануме і в мікромолярних концентраціях вбивають етіологічні агенти середнього отиту [4].

Багатофакторна природа патогенезу хронічного середнього отиту включає в себе складні взаємодії мікробних чинників, факторів ризику навколишнього середовища і генетичних факторів організму. Реакції організму на вірусні та бактеріальні патогени у випадках середнього отиту визначаються, здебільшого, експресією генів під час взаємодії організм-патоген [6]. Відносно імунітету в медико-біологічних дослідженнях упрочиваются позиції запозиченої з еволюційної біології концепції, згідно з якою існують дві альтернативні стратегії захисту від інфекції: стратегія резистентності, спрямована на детекцию і елімінацію впроваджуються патогенів; і стратегія толерантності, як здатність допускати (терпіти) присутність патогена [7]. Зміни цих двох фундаментальних механізмів захисту часто беруть участь в інших формах хронічних запальних захворювань і можуть бути пов'язані також зі схильністю до середнього отиту.

Метою роботи була оцінка стану молекулярно-генетичних основ активації елімінаційних механізмів природженого імунітету шляхом дослідження експресії генів антибіотичних пептидів кателіцідіна LL-37 і бета-дефенсин-1, -2, -3 людини в епітелії слизової оболонки середнього вуха при хронічних запальних захворюваннях на основі визначення мРНК.

Матеріал і методи

Матеріалом для дослідження служили 92 зразка слизової оболонки ЛОР-органів отримані під час планового хірургічного втручання в умовах загальної анестезії. Зразки тканин негайно поміщали в стабілізуючий розчин RNAlater. Досліджено зразки слизової оболонки барабанної і мастоідальной порожнини при різних формах хронічного середнього отиту і отосклерозі, в якості контрольної тканини служили зразки слизової нижніх носових раковин хворих з викривленням перегородки носа, як правило, використовується за даними літератури з цією метою. Другим контролем служили зразки здорової тканини слизової оболонки середнього носового ходу, отримані попутно в ході операцій. Зразки слизової оболонки мастоідальной порожнини отримані у випадках, коли обсяг операції вимагав розкриття клітин соскоподібного відростка.

Молекулярно-генетичні дослідження включали: виділення загальної РНК з операційного матеріалу, що включає поверхневий епітелій; синтез комплементарної до ДНК в реакції зворотної транскрипції; амплификацию з використанням специфічних праймерів і флюорофора SYBR Green (Bio-Rad) методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) в режимі реального часу. Рівень експресії мРНК стандартизировали щодо експресії гена бета-актину [8, 9]. Послідовності праймерів, використаних для ПЛР ампліфікації: LL-37: прямий 5 'tcaccagaggattgtgacttcaa 3' і зворотний 5 'tgagggtcactgtccccatac 3'; hBD-1: прямий 5 'tgctgtttactctctgcttacttttgt 3' і зворотний 5 'ccaaggcctgtgagaaagttacc 3'; hBD-2: прямий 5 'tgatgcctcttccaggtgttt 3' і зворотний 5 'ggatgacatatggctccactctt 3'; hBD-3: прямий 5 'tatcttctgtttgctttgctcttcc 3' і зворотний 5 'cctctgactctgcaataatatttctgtaat 3'; бета-актину людини: прямий 5 'gggtcagaaggattcctatg 3' і зворотний 5 'ggtctcaaacatgatctggg 3'.

Статистичну обробку даних проводили за допомогою програми GraphPad Prism 5 методами описової статистики з використанням непараметричних критеріїв відмінності (тест Манна - Уїтні). Значення p <0,05 розглядали як статистично значущі.

Результати дослідження та їх обговорення

Експресія генів LL-37 і hBD-1, -2, -3 детектувати в епітелії всіх обстежених груп операційного матеріалу (таблиця, рисунок). Найвища частота детекції експресії генів індуцибельних бета-дефенсин в порожнині середнього вуха виявлена ​​при отиті з холестеатомой: мРНК hBD-2: група 4 і контроль 1, групи 4 і 6 відношення шансів (ВШ) 8,80 (95% довірчий інтервал 1, 35 ÷ 57,43), групи 4 і 3 ОШ = 19,20 (1,88 ÷ 196,55), групи 4 і 5 ОШ = 5,87 (1,08 ÷ 32,00); група 4 і контроль 1, групи 4 і 6 відношення ризиків (ВР) 4,00 (1,05 ÷ 15,36), групи 4 і 3 ВР = 8,00 (1,16 ÷ 55,20); мРНК hBD-3: групи 4 і 6 ОШ = 14,00 (1,39 ÷ 141,49) (таблиця). Експресія гена LL-37 в контрольних групах епітелію носа детектувати в 100% випадків, тоді як в епітелії барабанної порожнини найрідше мРНК LL-37 виявлено при отосклерозі (стерильний процес) і отиті з холестеатомой: група 6 і контролі 1, 2 ОШ = 31 , 15 (1,53 ÷ 633,17), ВР = 3,17 (1,63 ÷ 6,14); група 4 і контролі 1, 2 ОШ = 23,40 (1,15 ÷ 477,59), ВР = 2,86 (1,57 ÷ 5,19).

Частота детекції експресії генів кателіцідіна LL-37 і бета-дефенсин-1, -2, -3 в епітелії слизової оболонки середнього вуха при хронічних запальних захворюваннях

№ групи

Зразки слизової оболонки

Частота детекції експресії генів

hBD-1

hBD-2

hBD-3

LL-37

Абс.ч.

%

Абс.ч.

%

Абс.ч.

%

Абс.ч.

%

1

Нижні носові раковини (контроль 1)

13/13

100

2/13

15,38

2/13

15,38

13/13

100

2

Слизова оболонка барабанної порожнини при хронічному туботімпанальном середньому отиті, центральна перфорація

13/13

100

5/13

38,46

6/13

46,15

9/13

69,23

3

Слизова оболонка барабанної порожнини при хронічному туботімпанальном середньому отиті, тимпаносклероз

13/13

100

1/13

7,69

5/13

38,46

9/13

69,23

4

Слизова оболонка барабанної порожнини при хронічному гнійному епіантральном середньому отиті, холестеатоме

13/13

100

8/13

61,54

7/13

53,85

7/13

53,85

5

Слизова оболонка мастоідальной порожнини при хронічному гнійному епіантральном середньому отиті, холестеатоме

14/14

100

3/14

21,43

4/14

28,57

10/14

71,43

6

Слизова оболонка суперструктури стремена при отосклерозі, приглухуватості

13/13

100

2/13

15,38

1/13

7,69

6/13

46,15

7

Слизова оболонка середнього носового ходу при кісті лобової пазухи / сфеноїдиті / кісті верхньощелепної пазухи / викривленні перегородки носа / епіфори / лікворі / дакриоцистите / чужорідне тіло верхньощелепної пазухи (контроль 2)

13/13

100

3/13

23,08

4/13

30,77

13/13

100

Рівні експресії гена LL-37 в епітелії середнього вуха знижені в порівнянні з порожниною носа: контроль 1 і групи 2, 4, 6 (p <0,001), 3, 5 (p <0,01); контроль 2 і групи 2, 4 (p <0,001), 5, 6 (p = 0,001) і 3 (p <0,01). У барабанної порожнини найвища експресія гена LL-37 детектувати при отосклерозі. Рівні конститувною експресії гена hBD-1 в епітелії барабанної порожнини, за винятком тимпаносклероз, вище, ніж у контролі: контроль 1 і групи 2, 6 (p <0,05), 4 (p <0,01); контроль 2 і група 4 (p <0,05), найбільш високі при отиті з холестеатомой. Рівні експресії гена hBD-2 підвищені при отиті з холестеатомой в порівнянні з контролем: контроль 1 і група 4 (p <0,01); контроль 2 і група 4 (p <0,05) і в порівнянні з тимпаносклероз і отосклерозом: групи 4 і 3, 6 (p <0,01). Найбільш високі рівні експресії гена hBD-3 виявлені при отиті з холестеатомой, найнижчі - при отосклерозі: контроль 1 і група 4 (p <0,05); групи 2 і 6 (p <0,05); групи 4 і 6 (p <0,02) (рисунок).

Відносна експресія мРНК кателіцідіна LL-37 і бета-дефенсин-1, -2, -3 людини в поверхневому епітелії слизової оболонки середнього вуха при хронічних запальних захворюваннях (середнє ± похибка середнього). Достовірність відмінностей приведена в тексті статті. Номери груп відповідають групам в таблиці

І в моделях середнього отиту у тварин, і в моделях культури епітеліальних клітин середнього вуха людини [2] продукція бета-дефенсин сильно зростає і формує молекулярну базу ефективної інактивації звичайних поширених патогенів, асоційованих із середнім отитом. У літературі описано конститутивні експресія гена бета-дефенсин миші mBD-1 в нормальної слизової середнього вуха і слухової труби (напівкількісна ПЛР) і зростаюча регуляція індуцібельной експресії генів і пептидів mBD-2, mBD-3 і mBD-4 (напівкількісна ПЛР і імуноблот) при експериментальному середньому отиті, тоді як нормальний туботімпанум мишей їх не експресуватися [10]. Швидке (4 години після інокуляції в вухо мишам NTHi) підвищення рівнів mBD-2 розцінювали як свідчення того, що єдиним джерелом мРНК mBD-2 були епітеліальні клітини середнього вуха, а не запальні клітини, тому що моноцити за цей час ще не інфільтрована порожнину середнього вуха [2].

Методами гібридизації in situ показано продукція мРНК гомолога кателіцідіна c CRAMP в епітелії слухової труби, методом ПЛР в реальному часі - в інших відділах верхніх дихальних шляхів шиншили [4]. Інкубація епітеліальних клітин середнього вуха шиншили з вірусними (вірус грипу A, аденовірус або респіраторно-синцитіальних вірус (RSV)) або бактеріальними (NTHi, M. catarrhalis або S. pneumoniae) патогенами, асоційованими із середнім отитом, показала різні специфічні для мікробів патерни зміни експресії (ПЛР в реальному часі) мРНК cCRAMP [4]. Інтраназальне зараження шиншил RSV знижувало експресію бета-дефенсин-1 шиншили cBD-1 (відповідає hBD-3) на рівнях мРНК (ПЛР в реальному часі) і білка в гомогенатах слизової оболонки носоглотки, носової раковини, перегородки носа і слухової труби, особливо в носоглоткових гирлі (ділянці з найбільшою експресією мРНК cBD-1), що призводило до утворення вогнищ вірусної репродукції на всьому протязі верхніх дихальних шляхів, включаючи слухову трубу, і посиленою колонізації носоглотки NTHi. Цей процес був звернемо при введенні шиншилам або рекомбінантного cBD-1, або рекомбінантного hBD-3 [3].

При дослідженні зв'язку між експресією бета-дефенсин і утворенням холестеатоми в нехолестеатомних контрольних зразках слизової оболонки середнього вуха людини показана конститутивні експресія мРНК hBD-1 (11/18) і індуцібельная експресія мРНК hBD-2 (37,5%) при хронічних інфекціях середнього вуха і холестеатоме [11]. У нашій роботі експресія генів LL-37 і hBD-1, -2, -3 детектувати в епітелії слизової оболонки барабанної і мастоідальной порожнин при різних формах хронічного середнього отиту і отосклерозі.

Як переважаючого етіологічного агента хронічного середнього отиту, рецидивуючого середнього отиту і ексудативного середнього отиту визнають NTHi [12]. Хронічний середній отит і рецидивний середній отит включають в себе компонент биопленок, які зазвичай містять S. pneumoniae, NTHi, коагулазо-негативні стафілококи або Staphylococcus aureus [13]. Найбільш частими патогенами хронічного гнійного середнього отиту і отиту з холестеатомой вважають Pseudomonas aeruginosa і S. aureus [13]. Відомо також, що hBD-2 проявляє потужну антимікробну активність відносно грамнегативних бактерій і Candida, проте менш ефективний щодо грампозитивних S. aureus [2]. Мабуть, відмінності колонізує патогенів зумовили виявлену нами максимальну частоту детекції та рівні експресії індуцибельних генів пептидів hBD-2 і hBD-3 в слизовій оболонці барабанної порожнини при отиті з холестеатомой. З цим спостереженням узгоджуються дані, отримані при вивченні бактеріальних інфекцій інших локалізацій. Наприклад, при експериментальному бактеріальному кератиті показано, що для резистентності мишей до індукованої P. aeruginosa інфекції рогівки необхідний mBD-2, а не mBD-1 [14].

[ U ] [ OT ] [ ST ] [ OST ] [ TG ] [ GTU ] id інші російська український білоруський польський англійська іспанська німецький турецька болгарська чеська угорський естонський вірменський казахський іврит грузинський сербський хорватський литовський словацький словенський албанський македонський латиська киргизький монгольський португальська узбецький корейський румунський датський грецький нідерландський норвезький шведський італійська французький індонезійська id арабська хінді бенгальський китайський [азербайджанський ] [Боснійський bs ] [таджицький ] [Латинський ] [В'єтнамський ] [Каннада kn ] [фінський ] [Філіппінський ] [Ірландський ] [Ісландський ] [Шотландський (гельський) gd ] [японський ] [Африкаанс ] [Амхарська am ] [каталанська ] [Себуанська ceb ] [корсиканська ] [Валлійський ] [Есперанто ] [Баскська eu ] [перський ] [Фризька ] [Галісійська ] [Гуджараті gu ] [хауса ] [Гавайський ] [Хмонг hmn ] [креольський (Гаїті) ht ] [ігбо ig ] [яванський ] [Кхмерский ] [Курманджі ] [Люксембурзький lb ] [лаоський ] [Малагасійська ] [Маорі ] [Малаялам ml ] [маратхі mr ] [малайський ] [Мальтійський ] [Бірманський my ] [непальська ] [Чева ny ] [панджабі ] [Пушту ] [Синдхи sd ] [сингальский si ] [Самоа ] [Шона sn ] [сомалійський ] [Сесото st ] [суданський ] [Суахілі ] [Тамільська ] [Телугу te ] [тайський ] [Урду ] [Кхоса xh ] [ідиш yi ] [йоруба yo ] [зулу ] [ TF ]
Notice: unserialize (): Error at offset 989 of 28672 bytes in /home/admin/web/server4.doubleclick.net.ru/public_html/scripts/lib/auto_load/save_data.php on line 120

Notice: Undefined variable: url_text in /home/admin/web/server4.doubleclick.net.ru/public_html/scripts/api/method/TranslateText.php on line 936
ні тексту
Контейнер пошкоджений! Спробуйте отримати статтю заново GetTextFromUrl.php , але це призведе до видалення всіх існуючих перекладів !!!