Малюнок 1 показує протокол про внесення змін у засобах масової інформації під час яєчників культури тканини. Після цієї програми, ICR 4 week-old мишей яєчники були культивували і образи інтервали 24-h, за допомогою конфокальної мікроскопії (рис. 2). У культурі тканин яєчника на 3 тижні найбільш порожнинна і вторинних фолікулів були виродилися, атрезії фолікулів і деякі були овуляцією (Малюнок 2 D і Таблиця 2). В аналізі фолікула областей за допомогою ImageJ (рис. 3) деякі фолікули розроблений в групах під час кожного циклу сплеск LH (рис. 3 B і Додаткові фільм 1). Крім того овуляція відбулася майже одночасно в окремий штучний яєчників з правого і лівого яєчників одного мишей. Береться до уваги, що час овуляції і кількість овуляцією ооцитів (Таблиця 2) відрізнялися між миші яєчників (дані не показані), овуляція від штучного яєчників переважно відбулася протягом 48 год LH перенапруг (рис. 3 і додаткових Фільм 1). Однак, не всі овуляцією ооцити випустила перший полярних органів після овуляції (Малюнок 2 E і Таблиця 2), і хоча овуляцією яйцеклітин може бути запліднена, розвиток припинився на стадії 4-секційний (дані не показані). Для з'ясування механізмів, які активуються початкове сплячих фолікулів в яєчниках миші, ми виявили первинних фолікулів активації в культурній тканини від трансгенних мишей проведення Oog1pro3.9 і R26-H2B-mCherry (трансгенів Малюнок 4, рис. 5 і Додаткові фільм 2). Ооцити Експрес дуже низький рівень Oog1 гена від стадії первинних фолікулів, і проміжок часу візуалізації відрізняється низькою AcGFP1-висловлюючи первинних фолікулів від високої AcGFP1-висловлюючи первинних фолікулів. Початкове і первинних фолікулів присутні одночасно в P4 миші яєчників, тоді як тільки первинних фолікулів в яєчниках Р0 (рис. 4 A, B). Таким чином ми оптимізували проміжок часу візуалізації умови для виявлення тільки первинних фолікулів в яєчниках культивували P4 (рис. 4 C). Згодом ми захопили зображення культивували P0 яєчників на 10 днів у однакових умовах (Малюнок 4 DG). AcGFP1 може використовуватися як індекс первинних фолікулів в цих трансгенних мишей і первинних фолікулів AcGFP1-позитивні були обнаруживаемая в культивовані P0 яєчників після культури 30-40 h (рис. 4, рис. 5 AF і додаткових Кіно 2). Початкове і первинних фолікулів в культивовані яєчників відрізнялися ядер mCherry позитивних клітин гранульози (рис. 5 B, E). Зокрема mCherry сигнали вказують форм фолікулів і дозволяють спостереження фолікула етапів в культивовані яєчників (рис. 5 B, E і H). Таким чином, ця система культури за допомогою яєчників від Oog1pro3.9 / мишей R26-H2B-mCherry показало процесу раннього розвитку фолікула від Братство пресвітеріан вторинних фолікулів етапів. Ці методи сприятимуть дослідження механізмів регулювання розвитку фолікула гонадотропін незалежні.
Малюнок 1: Час курс середнього зміни. Середній A містить 5% FBS, 100-му ФСГ, ЛГ 10-му, 100-од / мл пеніциліну і стрептоміцину 100 мг / мл в MEM-альфа. Середній B містить 5% FBS, 100-му ФСГ, ЛГ 100-му, 100-од / мл пеніциліну і стрептоміцину 100 мг / мл в MEM-альфа. Середній B був використаний для виробництва стрибків LH кожні 4. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Малюнок 2: Зображення культивували тканин яєчника. Зображення були захоплені інтервалом 24 год за допомогою конфокальної мікроскопії. (A) день культури 1; (B) день культури 5; (C) день культури 10; (D) день культури 13; (E) Magnified іміджу регіону вказали на площі в (D); ооцити ре були овуляція з фолікулів, позначається стрілками в B, C і D. ооцитів (F), випускаючи полярного тіла після овуляції; Шкали бар = 200 μm. будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Малюнок 3: Вимірювання фолікул районах культивували яєчники. (A) зображення культивували яєчників; пунктирні лінії позначають області вимірюється ImageJ. (B) фолікулярної районах культивували яєчників після 3 тижнів; сірі лінії представляють період культура з додаванням 100-мм LH (LH сплеск). Лінії показують етапи розвитку в кожен фолікул в культивовані яєчників; Шкали бар = 200 μm. будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Малюнок 4: гематоксиліном і еозином (H & E) фарбування зображення P0 і P4 яєчників і time-lapse томографії. (A) H & E плямувати P0 яєчників; (B) H & E плямувати P4 яєчників; (C) зображення P4 зав'язі від Oog1pro3.6 трансгенні миші після 10 h культури. Стрілка показує AcGFP1-позитивних первинних фолікулів. (DG) Образи P0 яєчників від трансгенних мишей, висловлюючи Oog1pro3.9 і R26-H2B-mCherry; зелений і червоний сигнали в D і F представляють AcGFP1 і mCherry, відповідно. Білі сигнали в E і G представляють AcGFP1 D і F, відповідно. D і E образи культивовані яєчників після 0,5 год культури. F і G Показати яєчників після 180 h культури; Шкали бар = 100 μm. будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Малюнок 5: зображення початкового, первинної і вторинних фолікулів в культивовані яєчників з oog1pro3.9 / R26-H2B-mCherry мишей. (C A -) Образи первинних фолікулів в культивовані P0 яєчників; (F D -) Образи первинних фолікулів в P0 культивовані яєчників; (H G -) Образи вторинних фолікулів в яєчниках культивували 4-тижневих миші. A, D і G є злиття зображень B і C, E і F і H і I, відповідно. Грін, AcGFP1; червоний, mCherry; Шкали бар = 100 μm. будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Мікроскопоб'єктивлазерекспозиції (МС)Отриматиінтервал часуz стекіншіЦифри і фільми
CV1000 X10 488 нм: 30, 561 Нм: 20 488 нм: 700, 561 Нм 600 488 нм: 90, 561nm: 20 30 хв. 5 мм Малюнок 4C-G, фільм 1 і 2 BZ-X700 X20 (з коміром колекції) 40% Авто X4 30 хв. 10 мм Біннінг 3 x 3 Фільм 3 LSM710 X10 488 нм: 6%, 564 Нм: 5% швидкість камери: 4 488 нм: 850, 564 Нм: 850 24 h 10 мм Цифрове збільшення, 488 нм: 2 564 nm: 1 Малюнок 2, 3 і 5
Таблиця 1: проміжок часу візуалізації умови. Проміжок часу візуалізації умова конфокальної і світлі області мікроскопи.
Яєчник ні.Кількість загального овуляцією ооцитівКількість MII ооцитів1 7 2 2 19 9 3 14 6 4 7 3 5 12 4 6 15 6 7 25 11 8 13 3 9 11 7 10 19 8 11 18 4 12 7 1
Таблиця 2: число овуляцією яйцеклітин в яєчниках штучного. Кількість овуляцією яйцеклітин з дванадцяти культивували яєчників; MII вказує кількість овуляцією ооцитів, які випущені перші полярного тіла після овуляції.
Додаткові фільм 1: проміжок часу фільм культивували яєчник. Яєчники були зібрані від 4 - тиждень старий мишей і були нарізаний і культивували протягом 3 тижнів. Фільм охоплює період культура 0 - 200 h в 10 кадрів в секунду будь ласка, натисніть тут для перегляду цього відео. (Правою кнопкою миші для завантаження.)
Додаткові фільм 2: проміжок часу фільм культивували P0 зав'язі від трансгенні миші. Грін, AcGFP1; червоний, mCherry. Фільм охоплює період культура 0 - 180 h в 10 кадрів в секунду будь ласка, натисніть тут для перегляду цього відео. (Правою кнопкою миші для завантаження.)
Додаткові фільм 3: Проміжок часу фільм культивували зав'язі від 4-тиждень старий миші. Грін, AcGFP1; червоний; mCherry; Фільм охоплює період культура 9 - 13 днів культури на 10 кадрів в секунду. Стрілки в першому зображенні позначають фолікулів в яких атрезія сталося під час культури. Будь ласка натисніть тут, щоб подивитися це відео. (Правою кнопкою миші для завантаження.)
