Одна з цілей цих досліджень є визначення проліферативної активності НПС, тобто, збільшення числа клітин. Це досягається шляхом оцінки синтезу ДНК клітин всього населення, високий обсяг підхід, який вимірює включення радіоактивних трасуючими нехтують тимидин в клітинних екстрактів і відображає всі клітини в S-фазі, чи є вони синтезує для 5 хвилин або всього дві години. Крім того ці аналізи дозволяють Визначення питомої осередків введіть S-фазі і числа загальної клітин, більш трудомісткий пробірного одиночних клітин. Клітини синтезувати ДНК в S-фазі, крок, який передує мітоз і поділ клітин, які повинні відбутися в цілях збільшення числа клітин. Оскільки ці процеси зайняти деякий час, зміни в синтезі ДНК, на 48 годин не можуть бути пов'язані зі змінами в число клітин в цей момент часу. Проте було встановлено, що зміни в синтезі ДНК, на 48 годин надійно передбачити збільшення числа клітин в 4 і 6 днів.
При оцінці синтез ДНК, клітини покриті на щільності 100000 клітин (~ 50% припливу) в 24-ну пластині і можуть рости за 48 годин до проведення вимірювань. За допомогою цього щільність гарантує, що клітини нагадують їх моношару навколишнього середовища, але також не ростуть так швидко, протягом 48 год, що засоби масової інформації стає занадто кислою. Засоби масової інформації, що є занадто кислою може істотно вплинути на метаболізм клітин і таким чином, змінити результати поширення. Якщо конкретних клітинних ліній високою проліферативною, дослідник слід розглянути можливість зміни клітин щільність, обсяг засобів масової інформації, або засоби масової інформації обмін частоти для запобігання дуже кислому умов. Якщо умови змінюються, важливо бути послідовним, при порівнянні різних клітинних ліній, тому що контакт залежні зміни в осередку безумовно впливає на темпи зростання. Простий дизайн цих аналізів дозволяє нам перевірити різні фактори росту. Як показано на малюнку 7, додавання фактор росту фібробластів (ФБП, 10 нг / мл) для 48 годин збільшує синтез ДНК на ~ 40%. Крім того пробірного синтезу ДНК відтворюваність як все клони і люди показують збільшення синтезу ДНК після стимуляції ФБП. Потенціал для базових і ФБП і стимулюється синтез ДНК серед різних зачіпає осіб, а також потенціал клонових мінливості в той же людина це показано в таблиці 1. Завдяки цій мінливості важливо перевірити кілька iPSC клонів на одиницю, а також оцінити як мінімум 3 до 5 рядків NPC похідним від кожного клону різних iPSC. Мінімум 3 експериментів для кожної лінії NPC була виконана.
Assay синтезу ДНК дозволяє нам швидко оцінити численні експериментальні групи в дусі високої пропускною спроможністю і міра відображає суму синтезу ДНК, незалежно від тривалості S-фаза (5 хвилин до 2 годин). Для визначення частки клітин в S-фазі, працював пробірного вхід S-фазі. Для цього assay клітини вирощують на такий же щільності, як згадувалося раніше дозволити моношару як динаміки відбуваються, але потім вони відокремити після 2 днів і можливість коротко дотримуватися пластин для проведення аналізу одного осередку. Підрахунок клітин в монослое може бути ускладнене через високу осередку в контакт і регіональної мінливості в пластині. Ця парадигма дозволяє нам моделі клітини як моношару і потім проаналізувати їх як окремі клітини. Він також діє як методологічно незалежного підтвердження даних, отриманих в assay синтезу ДНК. Як видно на малюнку 8, 48 годин ФБП (10 нг / мл) стимуляції збільшується частка клітин, фазу S ~ 25%.
При оцінці числа клітин, більш низьку щільність осередків використовується, ніж у вищезгаданих аналізів, з 50 000 осередків покриттям за добре 24 добре пластини. Знову ж це щільність був обраний для забезпечення що швидше клітинних ліній не ростуть так швидко, протягом 6-денний рН середовища стає занадто кислою і жовтіє. На малюнку 9 в той час як число клітин не можуть бути значно відрізняються між елементом управління і групами ФБП (10 нг / мл) в 2 дня, зміни в синтезі ДНК, на 48 год (рис. 7) прогнозування змін в число клітин в 4 і 6 днів.
У той час як NPC зазвичай вирощуються при високій щільності, neurite assay проводиться на щільності 50 000 клітин покриттям в 35-мм блюдо для того щоб оцінити окремі клітини. Навіть на цій низької щільності, ВЗНП культур Експрес цитоскелетних протеїнів і транскрипційні фактори, характерні для NPC NESTIN, SOX2 і PAX6 (Малюнок 10 AD). Це означає, що low-density культивування значно не змінює долю клітин в цей період часу. Крім того аналогічні low-density умови були використані в системах культури щури і миші для виявлення фенотипів, які були в кінцевому підсумку відтворювані в природних умовах 16,, 1718,19, 20,21,22,23. Після 48 годин інкубації невелика частина НІПи починають розширювати невритів, як показано на малюнку 11А і B і кількісно в графік на малюнку 11C. Частка клітин, які розширюють невритів, довжина невритів і кількість невритів / осередку можуть бути виміряні для оцінки розвитку параметрів. Для того, щоб точно оцінити відсоток клітин з neurite наріст, важливо, що клітини покриті як окремі осередки або кластери на малюнку 10 EF, клітин, які мають невритів (біла стрілка) також висловити незрілих нейрональних маркер тубулін бета III (TUJ1). Як уже згадувалося в методах, флуоресцентного зображення можуть бути придбані з TUJ1, забарвлених НПС і потім ці зображення можуть бути підраховані для частки TUJ1 + невритів забезпечити нейрональних походження процесів. У нашій лабораторії аналізи методом, або дали статистично аналогічні результати.
Простий дизайн і швидкий характер neurite assay також дозволяють нам перевірити наслідки внаслідок вад розвитку відповідних факторів росту і цитокінів пептиди. Наприклад, Малюнок 11 показує, що нейропептиди гіпофіза аденилатциклаза, активація поліпептид (PACAP, 3 Нм) збільшує neurite наріст в РНУ. PACAP є важливим фактором розвитку, має широке вираз в ЦНС і було показано, що мати важливе значення для розвитку мозку. Гризун дослідження в нашій лабораторії та інші лабораторії показали, що PACAP має широке залежить від стадії розвитку ефекти, такі як регулювання neurite наріст, міграції та проліферації в обох задній мозок і переднего16,22, 29,30,31. Недавні дослідження, проведені отаман і ін. (2016) з використанням штучного людини кірковихклітин фетальної вказують, що активність нейронів індукує 9 разів збільшення експресії генів PACAP, вказуючи значення пептидів в нейрональних розвитку человека32. Дійсно, Таблиця 2 показує відсоток невритів управління і PACAP (3 Нм) умов між численними лініями похідним від не впливає осіб. Як показано в таблиці 2, є деякі мінливість у відсотках невритів, виражена в клітинних ліній, отриманих від різних клонів з того ж і від NPC, отриманих від різних людей. Однак ці не впливає особи мають збільшення в neurite наріст у відповідь на PACAP, вказавши відтворюваність аналізів.
Як neurite наріст клітини міграція є важливим процесом розвитку необхідні для правильного підключення, Організації і проводки мозку. Neurospheres дозволяють нам вчитися NPC міграції в типовій високої щільності умова, яке підтримує контакт осередків серед NPC (Малюнок 12). Розвиваючих відповідні чинники також можуть бути перевірені на neurospheres для оцінки їх впливу на міграцію. Наприклад, на малюнку 12 показано, що PACAP (10 Нм) збільшує міграції РНУ.
Малюнок 1: NPC на прохід 3. NPC на P3 Експрес кілька етап специфічних маркерів, включаючи (A) плюрипотентних транскрипційні фактор, SOX2 транскрипційні фактор (B) для переднього НІПи, PAX6, і нестін NPC білків цитоскелету. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Малюнок 2: схема S-фаза вхід пробірного. Хронологія Assay вхід S-фазі. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Малюнок 3: кількісна вхід S-фазі. (A) фази зображення показані фази темний живої клітини (білі стрілки), фаза яскравий мертвих клітин (біла зірка) і етап яскраві живі клітини (зелена стрілка). (B) флуоресцентних DAPI пляма, показуючи конденсованих ядро в мертвих клітин (біла зірка) і великими ядрами в живій клітині (білі і зелені стрілки). (C) флуоресцентних EdU зображення показані яскраві EdU позитивні ядер (червона стрілка) і крапками EdU позитивні ядер (Червона зірка). (D) фази і флуоресцентні злиття зображень 3А - 3 C.
Малюнок 4: визначення невритів. Етап контраст зображення РНУ. (A) A осередки з процесом> 2 клітини тіла в довжину, тим самим зустріч критерієм для neurite. (B) осередки з процесом (C) представляє осередок з 2 процесів-тривалий процес оцінюється за критерієм neurite. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Малюнок 5: вибір neurospheres для міграції assay. (A) фаза контраст зображення представника поля neurospheres на 24 год. Сферах є все менш 100 мкм і таким чином, не збираються для assay перенесення. (B) етап контраст зображення представника поля neurospheres на 72 год. Всі сфери знаходяться в межах 100 мкм ± 20 мкм, про те, що вони готові бути зібрані для assay перенесення.
Малюнок 6: кількісна оцінка міграції. (A) фаза контраст зображення представник нейросфер. (B) синій контур відображає трасування для вимірювання загальної нейросфер області. Червоний показує контурі використовуються для вимірювання області внутрішні осередки маси. Міграція визначається як загальна нейросфер області внутрішня комірка маси. Зверніть увагу, що білі кола показують клітини, які не перебувають в суміжних килим, як ці клітини виключаються з контурів міграції. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Малюнок 7: Оцінка синтезу ДНК. Представник результати контролю в порівнянні з ФБП лікування РНУ. ФБП (10 нг / мл) збільшує синтез ДНК на 48 год (p ≤ 1 x 10-3). (N = 2-4 свердловин / групи / експеримент; 3 експериментів). Планки похибок представляють SEM.
Малюнок 8: частка клітин, S-фазу. (A) фаза контрастність зображення NPC клітини інкубували в управління в порівнянні з ФБП (10 нг / мл) обробленої ЗМІ 48 ч. Вставки представляють вище збільшення зображення клітин, вітражі для флуоресцентних EdU маркер управління і 10 нг / мл ФБП ЗМІ. Червоні стрілки показують, що клітини, які є EdU позитивні і білі стрілки вказують на клітини, які є EdU негативні. (B) граф представницьких результатів контролю проти ФБП (10 нг / мл) лікування РНУ. FGF збільшує S-фаза вхід на 48 год (p ≤1 x 10-3). (N = 2-4 страви / групи / експеримент; 3 експериментів). Планки похибок представляють SEM.
Малюнок 9: перерахування клітини на 2, 4 і 6 днів. (A) фаза контрастність зображення клітин в управління і ФБП (10 нг / мл) обробленої ЗМІ на 2, 4 і 6 днів. (B) граф представницьких результатів; Зверніть увагу що ФБП (10 нг / мл) завжди не збільшення числа клітин на 2 дня, але на 4 і 6 днів збільшується є очевидними (р ≤0.05). (N = 2-4 свердловин / групи / експеримент; 3 експериментів). Планки похибок представляють SEM.
Малюнок 10: характеристика НІПи в умовах низької щільності. (A, C, E) Фаза контрастність зображення РНУ в умовах низької щільності. (B) НІПи Експрес стовбурових / прогеніторних клітин маркери нестін (зелений), SOX2 (червоний) і ядерних маркерів DAPI (синій). (D) PAX6 (червоний), DAPI (синій). (F) щільністю, клітини, розширюючи невритів (біла стрілка) також висловити незрілих нейронах маркер TUJ1 (зелений). Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Малюнок 11: Neurite наріст. (A) фази контраст зображення РНУ. Чорні стрілки вказують на клітини з невритів. (B) Додавання нейропептіда PACAP (3 Нм) збільшує відсоток клітин з невритів (p ≤1 x 10-2). (C) кількісна оцінка наріст neurite управління і 3 Нм PACAP містять засобів масової інформації. (N = 2-4 страви / групи / експеримент; 3 експериментів). Планки похибок представляють SEM.
Малюнок 12: нейросфер міграції. (A) фаза контрастність зображення neurospheres. (B) крім PACAP (10 Нм) збільшує нейросфер міграції клітин (p розміром до 10-2) (C) кількісна оцінка міграції клітин. (N = 20 сферах / групи / експеримент, 3 експериментів). Планки похибок представляють SEM.
Пацієнт 1 1 21,853 47,538 2 20,336 38,070 Пацієнт 2 1 7,664 14,060 2 16,573 30,087
Таблиця 1: Синтез ДНК. Короткий виклад цінностей синтезу ДНК (в СУВП) РНУ похідним від двох клонів iPSC за незмінним двоє.
Засоби масової інформаціїПацієнтКлонувати #CTRLPACAP(3 Нм)Пацієнт 1 + 1 13,60% 18.10% 2 16.50% 21,10% Пацієнт 2 1 8,90% 14.10% 2 14.20% 21,10%
Таблиця 2: Відсоток клітин з невритів. Короткий виклад відсоток клітин, які мають невритів в NPC похідним від двох клонів iPSC за незмінним двоє.
