Визначення чутливості до антибіотиків: методи, результати, оцінка

1. зміст
2. Методи визначення чутливості до антибіотиків
3. Інтерпретація результатів визначення чутливості
4. Чутливі мікроорганізми (susceptible)
5. Резистентні мікроорганізми (resistant)
6. Мікроорганізми c проміжної резистентністю (intermediate)

Решедько Галина Костянтинівна,
к.м.н., асистент кафедри клінічної фармакології
Смоленської державної медичної академії
214019, Смоленськ, ул.Крупской, 28, а / с № 5.
Тел .: +7 (0812) 61 13 01, 61 13 27, Факс: (0812) 61 12 94,
E-Mail: [email protected]

зміст

резюме

У лекції розглянуті основні методи визначення чутливості in vitro мікроорганізмів до антимікробних препаратів (диско-дифузійний, Е-тестів, методи розведення). Відображено підходи до емпіричного і етіотропного призначення антибіотиків в клінічній практиці. Обговорено питання інтерпретації результатів визначення чутливості з клінічної та мікробіологічної точок зору.

В даний час в клінічній практиці існують два принципи призначення антибактеріальних препаратів: емпіричне і етіотропне. Емпіричне призначення антибіотиків засновано на знаннях про природну чутливості бактерій, епідеміологічних даних про резистентності мікроорганізмів в регіоні або стаціонарі, а також результати контрольованих клінічних досліджень. Безсумнівною перевагою емпіричного призначення хіміопрепаратів є можливість швидкого початку терапії. Крім того, при такому підході виключаються витрати на проведення додаткових досліджень.

Однак при неефективності антибактеріальної терапії, при нозокоміальних інфекціях, коли важко припустити збудника і його чутливість до антибіотиків прагнуть проводити етіотропну терапію. Етіотропне призначення антибіотиків передбачає не тільки виділення збудника інфекції з клінічного матеріалу, але і визначення його чутливості до антибіотиків. Отримання коректних даних можливо тільки при грамотному виконанні всіх ланок бактеріологічного дослідження: від взяття клінічного матеріалу, транспортування його в бактеріологічну лабораторію, ідентифікації збудника до визначення його чутливості до антибіотиків та інтерпретації отриманих результатів.

Друга причина, яка обумовлює необхідність визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів - це отримання епідеміологічних даних про структуру резистентності збудників позалікарняних і нозокоміальних інфекцій. У практиці ці дані використовують при емпіричному призначення антибіотиків, а також для формування лікарняних формулярів.

Методи визначення чутливості до антибіотиків

Методи визначення чутливості бактерій до антибіотиків діляться на 2 групи: дифузійні і методи розведення.

дифузійні методи
• з використанням дисків з антибіотиками
• за допомогою Е-тестів

методи розведення
• розведення в рідкому поживному середовищі (бульйоні)
• розведення в агарі

При визначенні чутливості диско-дифузійним методом на поверхню агару в чашці Петрі наносять бактеріальну суспензію певної щільності (зазвичай еквівалентну стандарту мутності 0,5 за McFarland) і потім поміщають диски, що містять певну кількість антибіотика. Дифузія антибіотика в агар призводить до формування зони пригнічення росту мікроорганізмів навколо дисків. Після інкубації чашок в термостаті при температурі 35о-37оС протягом ночі враховують результат шляхом вимірювання діаметра зони навколо диска в міліметрах ( Мал. 1 ).

Малюнок 1. Визначення чутливості мікроорганізмів диско-дифузійним методом.

Визначення чутливості мікроорганізму за допомогою Е-тесту проводиться аналогічно тестуванню диско-дифузійним методом. Відмінність полягає в тому, що замість диска з антибіотиком використовують смужку Е-тесту, що містить градієнт концентрацій антибіотика від максимальної до мінімальної ( Мал. 2 ). У місці перетину еліпсовою зони пригнічення росту з смужкою Е-тесту отримують значення мінімальної переважної концентрації (МПК).

Малюнок 2. Визначення чутливості мікроорганізмів за допомогою Е-тестів.

Безсумнівним достоїнством дифузійних методів є простота тестування і доступність виконання в будь-який бактеріологічної лабораторії. Однак з урахуванням високої вартості Е-тестів для рутинної роботи зазвичай використовують диско-дифузійний метод.

Методи розведення засновані на використанні подвійних послідовних розведень концентрацій антибіотика від максимальної до мінімальної (наприклад від 128 мкг / мл, 64 мкг / мл, і т.д. до 0,5 мкг / мл, 0,25 мкг / мл і 0,125 мкг / мл). При цьому антибіотик в різних концентраціях вносять в рідку живильне середовище (бульйон) або в агар. Потім бактеріальну суспензію певної щільності, що відповідає стандарту мутності 0,5 за MсFarland, поміщають в бульйон з антибіотиком або на поверхню агару в чашці. Після інкубації протягом ночі при температурі 35о-37оС проводять облік отриманих результатів. Наявність росту мікроорганізму в бульйоні (помутніння бульйону) або на поверхні агару свідчить про те, що дана концентрація антибіотика недостатня, щоб придушити його життєздатність. У міру збільшення концентрації антибіотика зростання мікроорганізму погіршується. Першу найменшу концентрацію антибіотика (з серії послідовних розведень), де візуально не визначається бактеріальний зростання прийнято вважати мінімальною переважної концентрацією (МПК). Вимірюється МПК в мг / л або мкг / мл ( Мал. 3 ).

Малюнок 3. Визначення значення МПК методом розведення в рідкому поживному середовищі.

Інтерпретація результатів визначення чутливості

На підставі отриманих кількісних даних (діаметра зони пригнічення росту антибіотика або значення МПК) мікроорганізми поділяють на чутливі, помірно резистентні і резистентні ( Мал. 4 ). Для розмежування цих трьох категорій чутливості (або резистентності) між собою використовують так звані прикордонні концентрації (breakpoint) антибіотика (або граничні значення діаметра зони пригнічення росту мікроорганізму).

Малюнок 4. Інтерпретація результатів визначення чутливості бактерій у відповідності зі значеннями МПК.

Прикордонні концентрації не є незмінними величинами. Вони можуть переглядатися, в залежності від зміни чутливості популяції мікроорганізмів. Розробкою і переглядом критеріїв інтерпретації займаються провідні фахівці (хіміотерапевти і мікробіологи), що входять в спеціальні комітети. Одним з них є Національний комітет по клінічних лабораторних стандартів США (National Committee for Clinical Laboratory Standards - NCCLS). В даний час стандарти NCCLS визнані в світі і використовуються як міжнародні для оцінки результатів визначення чутливості бактерій при багатоцентрових мікробіологічних і клінічних дослідженнях.

Існують два підходи до інтерпретації результатів визначення чутливості: мікробіологічний і клінічний. Мікробіологічна інтерпретація заснована на аналізі розподілу значень концентрацій антибіотика, що пригнічують життєздатність бактерій. Клінічна інтерпретація заснована на оцінці ефективності антибактеріальної терапії.

Чутливі мікроорганізми (susceptible)

Клінічно до чутливих відносять бактерії (з урахуванням параметрів, отриманих in vitro), якщо при лікуванні стандартними дозами антибіотика інфекцій, що викликаються цими мікроорганізмами, спостерігають хороший терапевтичний ефект.

При відсутності достовірної клінічної інформації підрозділ на категорії чутливості базується на спільному обліку даних, отриманих in vitro, і фармакокінетики, тобто на концентраціях антибіотика, досяжних в місці інфекції (або в сироватці крові).

Резистентні мікроорганізми (resistant)

До резистентним (стійким) відносять бактерії, коли при лікуванні інфекції, викликаної цими мікроорганізмами, немає ефекту від терапії навіть при використанні більш високих доз антибіотика. Такі мікроорганізми мають механізми резистентності.

Мікроорганізми c проміжної резистентністю (intermediate)

Клінічно проміжну резистентність у бактерій мають на увазі в разі, якщо інфекція, викликані такими штамами, може мати різний терапевтичний результат. Однак лікування може бути успішним, якщо антибіотик використовується в дозуванні, що перевищує стандартну, або інфекція локалізується в місці, де антибактеріальний препарат накопичується у високих концентраціях.

З мікробіологічної точки зору до бактерій з проміжною резистентністю відносять субпопуляцію, що знаходиться у відповідності зі значеннями МПК або діаметра зон, між чутливими і резистентними мікроорганізмами. Іноді штами з проміжною резистентністю і резистентні бактерії об'єднують в одну категорію резистентних мікроорганізмів.

Необхідно відзначити, що клінічна інтерпретація чутливості бактерій до антибіотиків є умовною, оскільки результат терапії не завжди залежить тільки від активності антибактеріального препарату проти збудника. Клініцистам відомі випадки, коли при резистентності мікроорганізмів, за даними дослідження in vitro, отримували хороший клінічний ефект. І навпаки, при чутливості збудника може спостерігатися неефективність терапії.

У певних клінічних ситуаціях, коли недостатньо результатів дослідження чутливості звичайними методами, визначають мінімальну бактерицидну концентрацію.

Мінімальна бактерицидна концентрація (МБК) - найменша концентрація антибіотика (мг / л або мкг / мл), яка при дослідженні in vitro викликає загибель 99,9% мікроорганізмів від вихідного рівня протягом певного періоду часу.

Значення МБК використовують при терапії антибіотиками, що володіють бактеріостатичну дію, або при відсутності ефекту від антибактеріальної терапії у особливої ​​категорії хворих. Окремими випадками для визначення МБК можуть бути, наприклад, бактеріальний ендокардит, остеомієліт або генералізовані інфекції у пацієнтів з імунодефіцитними станами.

На закінчення хотілося б відзначити, що на сьогоднішній день не існує методів, які дозволили б з абсолютною достовірністю прогнозувати клінічний ефект антибіотиків при лікуванні інфекційних хвороб. Однак, дані результатів визначення чутливості можуть служити хорошим орієнтиром клініцистам для вибору і корекції антибактеріальної терапії.

Таблиця 1. Критерії інтерпретації чутливості бактерій

література

1. NCCLS. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; ninth informational supplement M100-S9.- 1999.- V.19.- N.1.
2. Methods for the determination of susceptibility of bacteria to antimicrobial agents. EUCAST Definitive document // Clin Microbiol Infect.- 1998.- V.4.- P.291-296.