ДНК-залежна РНК-полімераза може здійснювати транскрипцію ДНК нормальних клітин і ДНК-вірусів. Як же здійснюється синтез РНК у тих вірусів , Які в геномі замість ДНК містять РНК ? Виявляється, в цих випадках вірусна РНК індукує утворення в клітинах господаря (наприклад, у Є. coli) РНК-залежною РНК-полімерази , Яка бере участь в реплікації вірусної РНК (Звідси друга назва ферменту - РНК-реплікази). фермент також використовується нуклеозидтрифосфат для синтезу одноцепочечной вірусної РНК . Цей синтез повинен пройти через стадію утворення репликативной форми. Отже, на I стадії РНК-реплікази на матриці РНК-вірусу специфічно будує комплементарних, з протилежного полярністю ланцюг РНК . Остання на II стадії служить матрицею для синтезу РНК , Абсолютно однотипної вихідної вірусної РНК . Обидві стадії катализируются одним і тим же ферментом , Хоча в кожній з них беруть участь різні білкові фактори. Слід особливо підкреслити, що, оскільки РНК-реплікази має відношення тільки до вірусам , Очевидно, на цьому підставі можуть бути розроблені ефективні антивірусні лікарські препарати.
синтез РНК з нуклеозіддіфосфатов. М. Грюнберг-Манаго і С. Очоа в 1955 р в клітинах Е. coli відкрили особливий фермент - полинуклеотид-фос-форілазу. цей фермент наділений здатністю синтезувати in vitro полімерну молекулу РНК з однотипних або різних рибонуклеозид-діфосфатов (ПДФ). реакція , Що є оборотною, протікає по рівнянню:
(НМФ) n + ПДФ -> (НМФ) n + 1 + Н3РO4.
Рібонуклеозідтріфосфатов і дезоксирибонуклеозидтрифосфатов не є субстратами ферменту . фермент не потребує матриці , Однак для синтезу необхідна приманки ланцюг РНК (НМФ) n з вільною 3'-гідроксильної групою, до якої приєднуються залишки моно-нуклеотидів. Новоутворена полімерна молекула РНК не має заданої специфічної послідовності мононуклеотидів, але містить 3 '-> 5' фосфодіефірні зв'язку, легко розриваються рібонуклеазою . Щодо біологічної ролі цього ферменту у бактерій припускають, що він каталізує, швидше за все, зворотний реакцію - розщеплення мРНК з утворенням нуклеозіддіфосфатов.
Отримані в лабораторії С.С. Дебов дані свідчать про більш значне поширення полирибонуклеотидов-фосфорілази в живих організмах , Ніж це визнавалося раніше. фермент відкритий також в клітинах тварин. Крім того, отримані експериментальні докази синтетичної функції полинуклеотид-фосфорілази. Цілком правомірно припущення, що цей фермент може брати участь у синтезі коротких полирибонуклеотидов в клітинах еукаріот в нормі і в деяких екстремальних умовах. Крім того, в лабораторних умовах фермент може знайти застосування для синтезу РНК-праймерів, що використовуються далі при синтезі ДНК .
проблеми генетичної інженерії . генетична інженерія , За визначенням А.А. Баєва, являє собою систему експериментальних прийомів, що дозволяють створювати в лабораторії (в пробірці ) Штучні біологічні структури. Як інструменти для генно-інженерних операцій застосовуються створені самою природою ферменти : Одні з них розсікають молекулу ДНК в суворо визначених ділянках ( рестріктази ), Інші, навпаки, зшивають розрізнені ділянки в єдине ціле ( лігази ). кінцевою метою генетичної інженерії є отримання організмів (Тварин і рослин) з новими спадковими властивостями за допомогою лабораторних прийомів. Для досягнення цієї поки що віддаленій цілі необхідно проведення величезної роботи на рівні окремого гена або генів . ген , Представлений певною ділянкою ДНК і відповідає певному білку , Можна або виділити з іншого організму , Або синтезувати хімічним або біологічним шляхом. Вперше в 1969 р з Е. coli була виділена ділянка ДНК з геном , Відповідальним за синтез ферменту , Що каталізує засвоєння молочного цукру ( лактози ), - так званий лактозна оперон . хімічний синтез гена аланиновой тРНК вперше здійснив Хар Гобінд Корану в 1970 р Що складається з 72 нуклеотидів , цей ген , Однак, позбавлений функціональної активності , Так як в клітинах тРНК синтезується в готовому вигляді, а у формі попередника . Ці дані послужили для Корани основою для синтезу гена-попередника тирозинового тРНК (З 126 нуклеоті-дів), хоча сама тирозинового тРНК складається з 85 нуклеотидів . Через громіздкість, а також недостатню ефективність хімічного синтезу в останні роки все більше місце займають біологічні методи синтезу генів за допомогою зворотної транскриптази ( ревертази ). Для цього необхідно мати мРНК , За допомогою якої можна відтворити відповідний ген . Синтезовані ДНК-копії на мРНК , що кодують синтез білка глобіну (Людини, кролика, миші, голуба, качки), імуноглобуліну , білка кришталика ока та ін. Однак на цьому шляху синтезу генів зустрічаються великі труднощі, пов'язані з виділенням з величезного розмаїття клітинних мРНК , Потрібної для синтезу гена .
Наступний етап генетичної інженерії - перенесення генів в клітку - здійснюється трьома способами: трансформацією (перенесення генів за допомогою виділеної з клітин і звільненій від домішок ДНК ), трансдукцией (перенесення генів за допомогою вірусів ) і гибридизацией клітин , Отриманих з різних організмів (Вищих тварин, мікроорганізмів та ін.) (рис. 13.7, 13.8). Заключний етап цих експериментів зводиться до адаптації введеного гена в організмі господаря, але він майже не залежить від мистецтва експериментатора.
Дослідження в області генетичної інженерії можуть служити основою для вирішення практичних завдань охорони здоров'я та сільського господарства. Отримані в лабораторії штучні гени , Крім широкого використання в мікробіологічної та фармацевтичної промисловості для приготування кормового білка і лікарських препаратів ( інсулін , інтерферон , гормон росту , гормони щитовидної залози , стимулятори імунітету і ін.), можливо, зможуть застосовуватися при лікуванні багатьох спадкових захворювань (Їх налічується близько 5000), генетичний дефект яких точно відомий поки тільки для невеликого числа (не більше 50) хвороб.
Перші спроби застосування лактозного гена при галактоземії ( спадкове захворювання , Пов'язане з непереносимістю галактози внаслідок відсутності ферменту гексозо-1-фосфат-уріділілтрансферази; см. главу 10) вселяють надію на реальні практичні можливості генетичної інженерії , Хоча цілком обгрунтовані тривога і побоювання, пов'язані з втручанням людини в сферу найтонших біологічних процесів спадкового апарату цілісного організму . В останні роки, після бурхливого періоду розквіту, в генетичної інженерії спостерігається деякий спад, обумовлений недостатністю знань про структуру і функціонування генома клітин еукаріот . Перехід від досліджень на клітинах прокариот до досліджень на клітинах еукаріот виявився утруднений низкою технічних складнощів внаслідок мозаїчний-ності структури генів останніх. Зокрема, відкриття екзонів і интронов в геномі , явища сплайсингу (Формування зрілої матричної РНК ) Вказує на необхідність дотримання високої точності процедури вирізання необхідного гена з ДНК генома відповідними рестріктазамі . В іншому випадку можуть бути отримані не структурні транслюються гени , а інтрони або ділянки екзонів , Що не кодують білок . Після того як були розроблені методи штучного синтезу і зшивання окремих ділянок молекули ДНК , З'явилася можливість конструювання і створення нових, невідомих раніше в природі організмів з наперед заданими властивостями. сучасна біотехнологія стала логічним розвитком цього напрямку науки. Вона склалася на основі фундаментальних досягнень біохімії , генетики і мікробіології, відкривши широкі можливості для створення нових сортів рослин, нових порід тварин і т.п. З огляду на виняткову важливість біотехнології для народного господарства, в 1985 р в нашій країні був створений і успішно працює міжгалузевий науково-технічний комплекс (МНТК) «Біоген». Комплекс був покликаний забезпечити створення і організацію промислового виробництва нових біологічно активних речовин і препаратів для медицини, ветеринарії, рослинництва на основі прогресивних біотехнологічних методів, в тому числі методів клітинної та генетичної інженерії .
Мал. 13.7. Схематичне зображення двох способів введення генів в клітку - трансформації і трансдукції (По А. А. Баєву).
Мал. 13.8. отримання гібридної молекули , Що містить одночасно ДНК вірусу SV40, ДНК фага λ, і галактозна оперон (Схема по А.А. Баєву).
Під дією ендонуклеази R1Е. coli кільцеві ДНК розриваються в одній точці, в результаті утворюються лінійні нитки. Під дією іншого ферменту - екзонуклеаза (з фага ) Коротшають нитки ДНК з протилежних кінців. Далі за допомогою ферменту кінцевий трансферази нарощуються нитки ДНК , Причому в однієї ДНК нові кінці складаються з аденілових (А), в іншої - з тіміділових (Т) залишків. при змішуванні молекул кінцеві залишки А і Т утворюють комплементарні пари , Замикаючи лінійні молекули в кільця. Спочатку ці кільця містять 4 розриву, які потім закриваються за участю ще одного ферменту - ДНК-лігази.
Попередня сторінка | Наступна сторінка
ЗМІСТ
