Вірусний штам Зика (PRVABC59; GenBank інвентарний номер KU501215) азіатського генотипу використовували в даному дослідженні 12. Веро клітини на 80% сплошности були використані для дослідження De Novo Zika вірусної інфекції. Для вірусного виробництва і подальшого вірусологічної характеристик, був застосований ранній перехід вірусу (P3) Зика. Вірусні бляшки спостерігалися на другий день після зараження. Зика вірусні потомства, що вивільняються з спочатку зараженої клітини можуть поширюватися на сусідні клітини, що призводить до утворення видимих бляшок на культурі моношару (рис 2). Цитопатичної ефект (ЦПЕ) від Зика вірусної інфекції характеризується морфологічними змінами, такими як заокруглення та від'єднання клітин, а також литической загибель клітин.
Для вимірювання титру вірусу, що містить вірус вільний від клітин супернатант збирали з Т-160 колби піддавали 10-ВОЛПd послідовне розведення і додають на монослое клітин Vero в 12-ямкового формату пластини (Малюнок 3). 48 ч момент часу після інокуляції використовували в якості кінцевої точки, щоб уникнути підрахунку бляшок, що виникають від вторинної інфекції. Свердловини з 30-100 бляшок були обрані для підрахунку, щоб отримати точний титр.
RT-КПЦР аналіз був використаний для оцінки реплікації генома вірусу Зика. Праймер пара пан-генотип специфічним для високо законсервованого ZIKV області NS5 був включений 3,16. Zika вірусний штам праймерів PRVABC59 специфічні на основі геномного розташування пан-генотипической праймерів (послідовності праймерів наведені в розділі 4.4.2 протоколу) також були протестовані. Обидві пари праймерів показали аналогічні рівні чутливості в посиленні Zika вірусного генома з інфікованих клітин (рисунок 4). В якості негативного контролю, вірусу гепатиту С-специфічні праймери були також протестовані 17. Значне інкрлегкость в змісті вірусного генома ZIKV спостерігалася між 48 і 96 год час точок як в низькій і високій MOI інфікованих клітин, що вказує на надійну вірусну інфекцію (рисунок 4) . Під час реплікації генома флавивирусов, двухцепочечной (DS) РНК replicatory проміжні утворюються шляхом освіти спарювання підстав між почуттям і антисмислової геномної РНК. Зонд антитіло специфічно для розпізнавання дсРНК виявлені вірусні інфіковані клітини (Малюнок 4). Вірусний дсРНК були локалізовані в цитоплазмі пропонуючи відділення реплікації генома. Іммуноцітохіміческіе фарбування показало розширення інфікованих вірусом клітин протягом 48 і 96 ч час очок.
Використовуючи систему інфекційного вірусу Зика культури, невелика бібліотека цитокінів піддавали скринінгу для визначення противірусної активності (малюнок 5). Клітини попередньо обробляли різними цитокінами протягом 12 год, а потім інфікують вірусом Зика. Тип I я nterferon, ІФН-α, справила сильне противірусну активність щодо вірусу Зика в широкому діапазоні випробуваних доз [10 міжнародних одиниць (МО), 100 МО і 1000 МО]. ІФН-β продемонстрували сильне інгібуючу дію, а також. Тип II IFN-γ також продемонстрували анти-Zika вірусної активності. Цитокіни TNF-α, IL-1 і IL-6, не пригнічує ZIKV при зазначених концентраціях препарату.
Малюнок 1 :. Загальна схема виробництва вірусу Зика і аналізу робочого процесу Для виробництва вірусу, ZIKV висівають на клітини Vero в Т-160 колбах для культури тканини. На 48 або 96 HPI, бесклеточного вірусу супернатант збирають і зберігають при -80 ° C для низхідного аналізу. Титр Вірус вимірюється за допомогою граничного аналізу розведення. Вірус інокулята Зика згодом використовується для вивчення кінетики реплікації вірусу і скринінгу лікарських соедіненій.HREF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54767/54767fig1large.jpg" цільових = "_blank"> Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.
Рис. 3: Наліт аналіз для вимірювання виробництва вірусу Зика Наївні клітини Vero були використані для вимірювання титру вірусу. Яскраві зображення поля зображують щільність вірусних бляшок при різних розведеннях (Шкала бар = 50 мкм). Примітка: 1 :. Розведення зображення 100 показує різні бляшки, які можуть бути точно підраховані Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.
Малюнок 4: Аналізи для оцінки реплікації вірусу Зика. > (A) Графік показує вірусу Зика геномної зміст було визначено за допомогою RT-КПЦР. І пан-генотип (ZIKV GEN) та PRVABC59-штам (ZIKV UNI) праймери показали однакову чутливість і специфічність. Як і слід було очікувати, гепатит С (HCV вірусні) праймери не зусилля будь-якої продукт. (B) Графік являє вірусні кінетики росту Зика на зазначені моменти часу в низьких і високих титрах інфікованих клітин в порівнянні з неінфікованих макеті контролю. Середні значення та стандартні відхилення наведені. (С) аналіз іммуноцітохіміческіе для дослідження вірусної реплікації. Вірус Зика Інфіковані клітини специфічно фарбували дсРНК антитілом. На 48 HPI, інфіковані клітини знаходяться в декількох кластерах, в той час як при 96 HPI більшість клітин інфіковані. Hoechst барвник використовується для візуалізації ядер (масштаб бар = 50 мкм). BF :. Світле поле зображення Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися велику версію цієї фігури ,
Малюнок 5 :. Інтерферони демонструють сильне анти-Zika вірусну активність (А) Графік, що показує модулювання Зика вірусного зростання за допомогою різних цитокінів в порівнянні з контрольним носієм. Середні значення та стандартне відхилення показано на гістограмі. Інтерферони показали статистично значуще пригнічення реплікації вірусу Зика (значення р <0,05). (В і С) фазового контрасту зображення Zika інфікованих вірусом клітин з лікуванням або без цитокина. Вірусні бляшки, утворені інфікованими клітинами можна розглядати як фокуси. Зверніть увагу, що інтерферон-оброблених свердловин не мають вірусні бл шки. Тестова модель управління без ZIKV інфекції включені в якості негативного контролю. (Шкала бар = 50 мкм) Будь ласка , натисніть тут для перегляду більшого версія цієї фігури.
