Проектування і дизайн
Тут був використаний приклад 134 пацієнтів з метастатичним колоректальний рак, які розслідуються протягом певного ряду біомаркерів. Мало того, що ngTMA планується для цих пацієнтів, але виділення ДНК з подальшим мутаційного аналізу для деякого заданого гена.
Під час планування та проектування фазі ngTMA, такі аспекти були вирішені. Від кожного пацієнта, 6 різних гістологічних регіони будуть досліджені: центр пухлини, інвазії пухлини фронт, райони щільної пухлини бутонізації (пухлини / строми взаємодія), нормальну тканину, метастазами в лімфатичні вузли і метастазами в печінку. Три пухлинні плям на площі пухлини тканин і дві нормальні плями тканини повинні бути включені в проект (п = 17 плям на одного пацієнта). Так, планується, що понад 50 відсотків біомаркери бути досліджені на цьому пацієнта матеріалу, дві копії остаточного ngTMA бажані. У зв'язку з можливим невеликим розміром лімфатичного вузла і Дістант метастази, невеликий діаметр сердечника 0,6 мм для ТМА будівництва для всіх тканин вибирається.
Крім того, планується, що в кожному регіоні окремо одягався, так що 6 ngTMAs містять різні гістологічні області буде проводитися: ngTMA містить тканин з) центр пухлини, б) вторгнення спереду, в) пухлини початківцям області, д) нормальна тканина, е) метастазів в лімфатичних вузлах, і е) метастази в печінку.
Для проектування ТМА з використанням 0,6 мм інструмент, зручним відстанню 0,4 мм між ударами буде обраний. Оскільки оцінка тканин плями в довгих рядків і стовпців часто втомлює, обрані два різних конструкцій. Для пухлинних блоків з 3 ударів в область тканини, дизайн, що містить шість частин створюється. Це призводить до загальної кількості 402 тканинних ударів. Для нормальних ударів тканини, 2 удари в разі повинні бути включені. Макет установки 432 ударів в цілому буде обраний.
Крім того, для кожного випадку, до 4Ядра в 0,6 мм буде додатково штампують і поміщають в 0,2 мл пробірки. Ці ядра тканини також будуть анотований.
Підводячи підсумок, 6 ngTMAs з різних тканин буде проводитися (5 масивів пухлинні х 3 удари х 134 пацієнтів; 1 нормальний масив тканини х 2 дироколи х 134 пацієнтів) на додаток до 4 ядер на пацієнта для труб. Взяті разом, 2814 анотації будуть.
Далі, відповідні H & E слайди з відібраних пацієнтів витягуються з архіву слайдів. Кожен випадок коротко відгуки патологоанатом і найбільш представницька слайди кожного типу тканини обрані.
сканування
Цифрові слайди кожного гістологічного зрізу зроблені для майбутнього анотації. Для цього дослідження, 3-4 тканини гірки, які будуть перевірятися в разі, тобто первинної колоректального раку, з або без прилеглих нормальних тканинах, метастазів в лімфовузлах і метастазів в печінці і, можливо, додатковий слайд мошенніковсодержащіе нормальну слизову оболонку.
До 10 різних журналів може бути повністю завантажена в слайд-сканера; Тому 250 слайдів можна сканувати за один прохід. Час для сканування і цифровий розмір слайдів змінюється в залежності від розмірів тканини і добротності бажаного. Діапазони добротності від 0 до 100 Тут, добротність 60 обраний, так як він робить менший сканування розмір файлу без помітної втрати якості сканування. Малі біопсії можуть бути відскановані в рамках 30 сек а в розділах вся тканину, як ті, які використовуються в цьому прикладі може зайняти від 2 до 10 хв. Цифровий розмір слайд може також варіюватися від 2 Мб до 2 Гб. Використання добротність 60, сканує між 600 Мб і 1 Гб виробляються.
Між 402 і 536 слайдів потрібні для цього проекту на загальну суму 3 сканування працює. Кожен прогін виконується на ніч. Приблизно 500 ГБ місця для зберігання не потрібно. Слайди скануються безпосередньо на цифровій платформі під назвою Case центр (ngtma.unibe.pathcasecenter). Справа центр доступний з будь-якої точки світу з веб-доступу, ввівши призначений ім'я користувача і пароль.
анотація
Для анотації, два аспекти слід вважати: 1) різні області тканин слід приділяти різних кольорів анотації і 2) кількість анотації повинен відображати кількість необхідних копій остаточного ngTMA.
В цьому випадку, 3 місця в області пухлини на єдиному екземплярі, були обрані. Для 2-х примірниках, кожен регіон повинен мати анотацію за допомогою 6 місць. Корисні зелений для нормальної тканини, синій для центру пухлини, жовтий для вторгнення пухлини спереду, червоний для областей пухлини початківцям (пухлина / строми) взаємодія, чорний для метастазів в лімфовузлах, бірюзи для віддалених метастазів і, нарешті, білий для регіонів, щоб бути використовується для труб. Анотація кожному випадку потрібно 2-3 хв.
ngTMA Будівництво
Це дослідження вимагає 6 ngTMA блоки то бути побудований в 2-х примірниках, в результаті чого 12 кінцевих блоків. Максимальна кількість блоків одержувачів, які можуть бути підтримані arrayer є 12. Кожен блок пухлина буде містити 402 тканин плями і кожна нормальна блок тканини буде містити 268 місць на загальну суму 4 556 місць по всій проекту.
Макет ТМА створюється для кожного блоку одержувача і збереженні проекту (6А, 6Б). 60 тканинні блоки можуть бути завантажені в тканини microarrayer паралельно; Образ кожного донора блоку береться. Починаючи з першого донорів блоку, відповідний анотований цифровий слайд витягується з Case центру. Слайд відповідності виконується, які можуть зайняти від 1-3 хв. Анотації підтверджуються і arrayer буде запропоновано почати пробивати (малюнок 7). Ядро штампування і час пересування становить приблизно 12 сек. Втрата сердечників під час цієї процедури є мінімальним. Загальний час для збудувавши цей проект становить близько 24 год, в тому числі час для SLIде / блок зіставлення і перезавантаження приладу. Деякі приклади ngTMA показані на фіг.8. Сердечники для подальшого молекулярного аналізу також може бути вибиті в цей час (Малюнок 8B).
Малюнок 1) 'донор' блок. Аналіз кернів з донорів блоку штампують і переносять в B) блоку одержувача, або тканини мікрочіпів (TMA).
Малюнок 2 Звичайний робочий процес тканини мікрочіпів.) Гістологічних препаратів витягуються з архіву і B) приділяється патологоанатом F або відгук. CD) Анотації зроблені на слайдах із зазначенням 'сайту' регіон для передачі. Е) Відповідні блоки тканини витягуються. F) Блок і слайд порівнюються для порівняння, які можуть G) іноді бути складним завданням. HJ) тканин microarraying то має місце. K) Сердечники неодноразово передавала і L) остаточне ТМА будується.
Малюнок 3) До 25 слайдів можуть бути розміщені в кожній журналу для сканування. B) Коригування до добротності і розмір можна зробити. Сканування прогрес можна спостерігати.
"SRC =" / файли / ftp_upload / 51893 / 51893fig4highres.jpg "ширина =" 600 "/>
Фігура 4) Відскановані слайди можуть бути завантажені на веб-платформи, Case центр. B) Цифрові гірки можна переглянути. В анотації інструмент ТМА дозволяє користувачеві вибрати розмір ядра і необхідне для анотації. C) Анотації можуть бути розміщені безпосередньо на цифровий слайд колір. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.
Малюнок 5) До 60 блоків можуть завантажують, а саме 10-донори блоки в ряду і 12 одержувачів блоки, а також. B) зображення кожного донора блоку тканини microarrayer береться, Digitaл слайд витягується. Узгодження блоку і слайд робиться і анотації використовуються для блоку штампування. C) Хід збудувавши можна контролювати, коли прилад штампування. D) Після штампування виконується, експорт розташування кожного плями в макеті, але також образ кожного донора блоку з відповідними анотаціями проводиться.
Малюнок 6. Ці макети ТМА були використані для упорядкований масив) пухлинні блоки і б) нормальних тканин.
Малюнок 7. Скріншот програмного забезпечення тканин microarrayer. Зліва, 12 повторноcipient блоки можуть бути поміщені в приладі. На дні, образи кожного донора блоку приймаються. У центрі, на макеті ТМА, прогрес штампування, а також збільшені зображення кожного донора блоку з анотаціями знайдений.
Малюнок 8) Деякі приклади новостворених ngTMA блоків. B) Додаткові удари тканини можуть бути прийняті для подальшого молекулярного аналізу. Ці жили штампують і поміщають в 0,2 мл пробірки.
Малюнок 9. Приклади біомаркерів додатків ngTMA.) Імуногістохімія фарбування Ki67 в колоректального раку. Подвійний HER2 імуногістохімії / неідентифікованими аналіз показує B) низьку експресію білка (коричневий) і не ампліфікації гена Her2 (чорний) по відношенню до центромери (червоний), в) високий рівень експресії білка (коричневий) і ампліфікації генів Her2 (чорний) по відношенню до центромери (червоний). D) хромогенні на місці гібридизації Her2 показуючи самотній стенограми мРНК при раку молочної залози ngTMA. E) Імуногістохімія для CD8 в колоректального раку. F) Двомісний імуногістохімії пляма для пан-цитокератин маркера AE1 / AE3 (коричневий; пухлинних клітин) і CD68 (червоний ;. Макрофагів), підкресливши мікросередовище пухлини при раку прямої кишки Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.
