Ці живі істоти вже ніколи не зможуть жити на волі. Їх геном багаторазово перекроєний заради лише одного завдання - невтомно працювати на людину. Мільйони цих біороботів виробляють у величезних кількостях те, що самим їм практично не потрібно. Вони чинять опір, вони хотіли б жити по-іншому, але хто ж їм це дозволить?
За вступним пасажем, написаному в стилі антиутопії, насправді стоїть повсякденна реальність. Йдеться про мікроорганізмах, спеціально адаптованих для роботи в біотехнологічному виробництві. Взагалі-то мікроорганізми - бактерії і гриби - «вколюють» на людство з незапам'ятних часів, причому до відкриттів Луї Пастера люди навіть не здогадувалися, що, замішуючи дріжджове тісто, сквашивая молоко, виготовляючи вино або пиво, вони мали справу з роботою живих істот.
У пошуках суперздатність
Але як би там не було, інтуїтивно, методом стихійної селекції за тисячоліття людям вдалося відібрати з природних, «диких» форм мікроорганізмів високоякісні культури для виноробства, сироваріння, хлібопечення. Інша справа, що вже в новітню епоху працьовитим бактеріям були знайдені нові застосування. Виникли великотоннажні біотехнологічні підприємства по виробництву, наприклад, таких важливих хімічних продуктів, як амінокислоти або органічні кислоти.
Суть біотехнологічного виробництва в тому, що мікроорганізми, поглинаючи вихідна сировина, наприклад цукор, виділяють якийсь метаболіт, продукт обміну речовин. Цей метаболіт і є кінцевим продуктом. Проблема лише в тому, що в клітці присутні кілька тисяч метаболітів, а виробництву потрібен якийсь один, зате в дуже великих кількостях - наприклад, 100 г / л (при тому, що в природних умовах метаболіт вироблявся б в кількостях, на два- три порядки менших). Ну і зрозуміло, бактерії повинні працювати дуже швидко - видавати потрібний обсяг продукту, скажімо, за дві доби. Такі показники диких форм вже не під силу - для цієї «потогінній» системи потрібні супермутанти, організми з десятками різних модифікацій геному.
Ближче до природи
Тут варто задатися питанням: а навіщо взагалі залучати біотехнології - хіба хімічна промисловість не справляється з виробництвом тих же амінокислот? Справляється. Хімія в наші дні може багато, однак у біотехнологій є кілька серйозних переваг. По-перше, вони оперують поновлюваними ресурсами. Зараз в якості сировини в основному використовуються крохмале- і цукровмісні рослини (пшениця, кукурудза, цукрові буряки). В майбутньому, як вважається, буде активно застосовуватися целюлоза (деревина, солома, макуха). Хімічна галузь працює переважно з викопними вуглеводнями.
По-друге, в основі біотехнологій лежать ферменти живих клітин, які працюють при атмосферному тиску, нормальній температурі, у водних неагресивних середовищах. Хімічний ж синтез протікає, як правило, при величезному тиску, високих температурах, з використанням їдких, а також вибухо-і пожежонебезпечних речовин.
По-третє, сучасна хімія побудована на застосуванні каталітичних процесів, а в ролі каталізаторів, як правило, виступають метали. Метали не належать до поновлюваному сировини, а застосування їх ризиковано з точки зору екології. У біотехнології функцію каталізаторів виконують самі клітини, і при необхідності клітини легко утилізувати: вони розкладаються на воду, вуглекислий газ і невелика кількість сірки.
І нарешті, четверте перевага укладено в властивості одержуваного продукту. Наприклад, амінокислоти є стереоізомерами, тобто молекули мають дві форми, які мають однаковою структурою, але просторово організовані як дзеркальні відображення один одного. Оскільки L- і D- форми амінокислот по-різному заломлюють світло, такі форми називають оптичними.
Хімія проти біотехнології
З точки зору біології, між формами є істотна відмінність: тільки L-форми є біологічно активними, тільки L-форма використовується клітиною як будівельний матеріал для білка. При хімічному синтезі виходить суміш ізомерів, витяг з неї правильних форм - окремий виробничий процес. Мікроорганізм ж, як біологічна структура, продукує речовини тільки однієї оптичної форми (в разі амінокислот - тільки в L-формі), що робить продукт ідеальним сировиною для фармацевтики.
Битва з кліткою
Отже, завдання підвищення продуктивності для біотехнологічних виробництв природними штамами вирішити не можна. Необхідно використовувати методи генної інженерії, щоб фактично змінити стиль життя клітини. Всі її сили, вся її енергія, і все, що вона споживає, має бути направлено на убогий зростання і (в основному) на виробництво у великих кількостях потрібного метаболіти, будь то амінокислота, органічні кислоти або антибіотик.
Яким чином створюються бактерії-мутанти? У недавні часи це виглядало так: брали дикий штам, потім проводили мутагенезу (тобто обробку спеціальними речовинами, які підвищують кількість мутацій). Оброблені клітини розсівали, отримували тисячі окремих клонів. І були десятки людей, які перевіряли ці клони і шукали ті мутації, які найбільш ефективні в якості продуцентів.
Найбільш перспективні клони відбирали, і наступала черга наступної хвилі мутагенезу, і знову розсіювання, і знову відбір. По суті, все це мало чим відрізнялося від звичайної селекції, давно використовується в тваринництві та рослинництві, якщо не брати до уваги застосування мутагенезу. Так десятиліттями вчені відбирали кращих з численних поколінь мікроорганізмів-мутантів.
Сьогодні використовується інший підхід. Все тепер починається з аналізу шляхів метаболізму і виявлення основного шляху конверсії цукрів до цільового продукту (а шлях цей може складатися з півтора десятка проміжних реакцій). Адже в клітці, як правило, є багато побічних шляхів, коли вихідна сировина йде на якісь зовсім непотрібні виробництва метаболіти. І для початку всі ці шляхи потрібно відсікти, щоб конверсія прямувала безпосередньо на цільової продукт. Як це зробити? Змінити геном мікроорганізму. Для цього використовуються спеціальні ферменти і невеликі фрагменти ДНК - «праймери». За допомогою так званої поліциклічної реакції в пробірці можна витягнути з клітки окремий ген, скопіювати його в великій кількості і піддати його зміни.
Наступне завдання - повернути ген в клітину. Уже змінений ген вставляють в «вектора» - це невеликі кільцеві молекули ДНК. Вони здатні переносити змінений ген з пробірки знову в клітку, де він заміщає колишній, нативний ген. Таким чином можна ввести або мутацію, яка повністю порушує функцію непотрібного виробництва гена, або мутацію, яка змінює його функцію.
У клітці існує дуже складна система, що перешкоджає виробництву в надмірній кількості будь-якого метаболіту, того ж лізину наприклад. Природним шляхом він виробляється в кількості приблизно 100 мг / л. Якщо його виявляється більше, то сам лізин починає пригнічувати (сповільнювати) початкові реакції, що ведуть до його виробництва. Виникає негативний зворотний зв'язок, виключити яку можна лише за допомогою введення в клітину черговий генної мутації.
Однак розчистити шлях сировини до кінцевого продукту і зняти вбудовані в геном заборони на зайве виробництво необхідного метаболіти - це ще не все. Оскільки, як уже говорилося, формування потрібного продукту проходить всередині клітини певну кількість стадій, на кожній з них може виникнути «ефект пляшкового горлечка». Наприклад, на одній зі стадій фермент працює швидко і проміжного продукту виробляється багато, а на наступній стадії пропускна спроможність падає і незатребуваний надлишок продукту загрожує життєдіяльності клітини. Значить, необхідно посилити роботу гена, який відповідає за повільну стадію.
Посилити роботу гена можна, підвищивши його копийность - іншими словами, вставивши в геном не одну, а дві, три або десять копій гена. Інший підхід - «підшити» до гену сильний «промоутер», або ділянку ДНК, що відповідає за експресію конкретного гена. Але «розшивка» одного «пляшкового горлечка», зовсім не означає, що воно не виникне на наступній стадії. Тим більше що чинників, які впливають на перебіг кожної стадії отримання продукту, дуже багато - необхідно враховувати їх вплив і вносити корективи в генну інформацію.
Таким чином «змагання» з кліткою може тривати довгі роки. На вдосконалення біотехнології виробництва лізину пішло приблизно 40 років, і за цей час штам «навчили» виробляти за 50 годин 200 г лізину на літр (для порівняння: чотири десятиліття тому цей показник дорівнював 18 г / л). Але клітина продовжує чинити опір, адже такий режим життєдіяльності для мікроорганізму вкрай важкий. Працювати у виробництві вона явно не хоче. І тому, якщо регулярно не стежити за якістю клітинних культур, в них неминуче виникнуть мутації, що знижують продуктивність, які будуть охоче підхоплені відбором. Все це говорить про те, що біотехнологія - це не така річ, яку можна розробити одноразово, а потім вона буде діяти сама. І необхідність підвищувати економічну ефективність і конкурентоспроможність біотехнологічних виробництв, і запобігання деградації створених високопродуктивних штамів - все вимагає постійної роботи, в тому числі фундаментальних досліджень в області функцій генів і клітинних процесів.
Залишається одне питання: а чи не є організми-мутанти небезпечними для людини? Що якщо вони потраплять з біореакторів в навколишнє середовище? На щастя, небезпеки ніякої немає. Ці клітини збиткові, вони абсолютно не пристосовані до життя в природних умовах і неминуче загинуть. У мутанта клітці все так змінили, що вона може рости лише в штучних умовах, в певному середовищі, при певному типі харчування. Зворотного шляху в дике стан для цих живих істот вже немає.
Автор - заступник директора ДержНДІгенетика, доктор біологічних наук, професор
Стаття «Працьовиті мутанти» опублікована в журналі «Популярна механіка» ( №3, Лютий 2014 ).
Вони чинять опір, вони хотіли б жити по-іншому, але хто ж їм це дозволить?Яким чином створюються бактерії-мутанти?
Як це зробити?
Залишається одне питання: а чи не є організми-мутанти небезпечними для людини?
Що якщо вони потраплять з біореакторів в навколишнє середовище?
