1 Дубініна В.Г. 1 Носенко О.М. 1 Головатюк Є.П. 2 Макшаева Е.Т. 2 Пацкова А.І. 3 Косюга О.Н. 4
1 Одеський національний медичний університет
2 ТОВ «Медичний центр репродуктивного здоров'я« Гамета »
3 Університетська клініка «Центр відновної та реконструктивної медицини» Одеського національного медичного університету
4 Комунальне підприємство «Клінічна міська лікарня номер 1» м.Одеси
Метою дослідження стало вивчення особливостей каріотипу викиднів від жінок з повторними мимовільними переривань вагітностей, що настали після проведення запліднення in vitro і природного зачаття в залежності від віку. Проведено цитогенетичні дослідження 440 зразків ворсин хоріона від подружніх пар зі звичним невиношуванням вагітності, серед яких 240 пар з вагітностями, що настали після проведення запліднення in vitro, і 200 пар з вагітностями, що настали при природному зачатті. Встановлено, що частота викиднів з аномальним каріотипом після запліднення in vitro зустрічається рідше в порівнянні з такими при природному зачатті в 1,44 рази. Аутосомні трисомії представляють найбільш поширені хромосомні аномалії викиднів як після запліднення in vitro, так і після природного зачаття. Відмінними рисами викиднів після запліднення in vitro в порівнянні з такими після природного зачаття є велика частота аутосомних трисомій в 1,28 рази і менша зустрічальність полиплоидией і структурних хромосомних аномалій відповідно в 3,43 і 4,14 рази. У групі жінок 35 років і старше частота хромосомних аномалій вища за таку у пацієнток до 35 років при заплідненні in vitro в 1,63 рази, а при природному зачатті - в 1,23.
ключові слова: мимовільний аборт
запліднення in vitro
природне зачаття
викидень
ворсинихоріона
каріотип
хромосомні аномалії
цитогенетика
1. A comparative cytogenetic study of miscarriages after IVF and natural conception in women aged under and over 35 years / AA Pendina, OA Efimova, OG Chiryaeva [et al.] // J. Assist. Reprod Genet. - 2014. - Vol. 31, № 2. - Р.149-155. doi: 10.1007 / s10815-013-0148-1.
2. Aneuploidy in Early Miscarriage and its Related Factors // Ch.-W. Jia, Li Wang, Y.-L. Lan [et al.] // Chin. Med. J. (Engl). - 2015. - Vol. 128, № 20. - P. 2772-2776. doi: 10.4103 / 0366-6999.167352.
3. Characteristics of chromosomal abnormalities diagnosed after spontaneous abortions in an infertile population / Werner M., Reh A., Grifo J. [et al.] // J. Assist. Reprod. Genet. - 2012. - Vol. 29, № 8. - Р.817-820. doi: 10.1007 / s10815-012-9781-3.
4. Chromosomal abnormalities in spontaneous abortion after assisted reproductive treatment / Kim JW, Lee WS, Yoon TK [et al.] // BMC Med. Genet. 2010. - Vol. 11: 153. Published online 2010 November 3. doi: 10.1186 / 1471-2350-11-153.
5. Chromosomal analysis of couples with repeated spontaneous abortions in northeastern Іran / Ghazaey S., Keify F., Mirzaei F. [et al.] // Int. J. Fertil. Steril. - 2015. - Vol. 9, № 1. - Р.47-54.
6. Chromosome abnormalities identified in 457 spontaneous abortions and their histopathological findings / Yakut S.1., Toru HS, Çetin Z. [et al.] // Turk. Patoloji Derg. - 2015. - Vol. 31, № 2. - Р.111-118. doi: 10.5146 / tjpath.2015.01303.
7. Comparison of blastocyst transfer with or without preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy screening in couples with advanced maternal age: a prospective randomized controlled trial / Staessen C., Platteau P., Van Assche E. et al. // Hum. Reprod. - 2004. - Vol. 19, № 12. - P. 2849-2858.
8. Comparison of chromosomal abnormality rates in ICSI for non-male factor and spontaneous conception / Bingol B., Abike F., Gedikbasi A. [et al.] // J. Assist. Reprod. Genet. - 2012. - Vol. 1. - Р.25-30. doi: 10.1007 / s10815-011-9646-1.
9. Cytogenetic abnormalities in 1 162 couples with recurrent miscarriages in southern region of India: report and review / Dutta UR, Rajitha P., Pidugu VK [et al.] // J. Assist. Reprod. Genet. - 2011. - Vol. 28, № 2. - Р.145-149.
10. Effects of increased paternal age on sperm quality, reproductive outcome and associated epigenetic risks to offspring / R. Sharma, A. Agarwal, VK Rohra [et al.] // Reprod. Biol. Endocrinol. - 2015. - Vol. 13: 35. Published online 2015 April 19. doi: 10.1186 / s12958-015-0028-x.
11. Kushnir VA Aneuploidy in abortuses following IVF and ICSI / VA Kushnir ,, JL Frattarelli // J. Assist. Reprod. Genet. - 2009. - Vol. 26, № 2-3. - Р. 93-97.doi: 10.1007 / s10815-009-9292-z.
12. Nagaoka So I. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem / So I. Nagaoka, TJ Hassold, PA Hunt // Nat. Rev. Genet. - 2012. - Vol. 13, № 7. - P. 493-504. doi: 10.1038 / nrg3245.
У першому триместрі викидень є найбільш поширеним ускладненням репродукції людини з частотою в діапазоні між 50% до 70% всіх зачать. Близько 15% клінічно встановлених вагітностей призводять до спонтанного аборту в першому триместрі [5]. Більшість клінічно розпізнаваних мимовільних переривань вагітності відбуваються між сьомою та одинадцятої тижнем вагітності. Є кілька основних етіологічних чинників, які можуть бути пов'язані з втратами вагітності: генетичні, ендокринні, імунологічні, екологічні, інфекційні [11].
У парах, які страждають від повторюваних самовільних абортів, поширеність хромосомних аномалій варіює від 2 до 8% [9]. Клінічні результати дисбалансів кариотипа, як правило, смертельні для розвитку ембріона, що призводить до повторюваних мимовільних абортів або до ранньої неонатальної смертності [9].
Особливо це стосується жінок старше 35 років, як при екстракорпоральному заплідненні, так і при інтрацитоплазматичної ін'єкції сперматозоїдів (ІКСІ) [1]. Інші дослідники вказують на відсутність підвищеного ризику хромосомних аномалій в зв'язку заплідненням in vitro за винятком великого числа статевих хромосомних аномалій в групі ІКСІ з чоловічим безпліддям, тобто ці зміни можуть бути пов'язані з батьківськими аномаліями, а не з самою процедурою ІКСІ [3]. У дослідженнях B. Bingol et al. (2012) [8], А.A. Pendina et al. (2014 року) [1] не було знайдено ніякої різниці в спектрі аномалій каріотипу викиднів між жінками, які зачали через запліднення in vitro, і тими, хто зачав природно. Деякі дослідження показали підвищений ризик викидня і числа анеуплоїдій при збільшенні віку батьків [1, 10].
Метою дослідження стало вивчення особливостей каріотипу викиднів від жінок з повторними мимовільними переривань вагітностей, що настали після проведення запліднення in vitro і природного зачаття в залежності від віку.
Матеріал і методи
Проведено цитогенетичні дослідження 440 зразків ворсин хоріона від подружніх пар зі звичним невиношуванням вагітності, серед яких 240 пар з вагітностями, що настали після проведення запліднення in vitro (група I), і 200 пар з вагітностями, що настали при природному зачатті (група II). Залежно від віку в групах I і II виділені групи IА (n = 122) і II А (n = 118), в яких вік жінок був менше 35 років; групи Іб (n = 118) і II Б (n = 82), де вік жінок був не менше 35 років.
Діагноз звичного невиношування вагітності виставлявся на підставі наявності у жінок з обстежених подружніх пар самовільних абортів при вагітностях, що наступили при природному зачатті і / або в циклах запліднення in vitro. Біохімічні вагітності не враховувалися.
Щоб уникнути забруднення материнської крові, зразки абортивного матеріалу, що містять ворсинихоріона, промивали тричі на фізіологічному розчині. Отриманий препарат ворсин хоріона (5-10 мг) поміщали в чашку Петрі діаметром 40 мм з розчином Хенкса з гепарином (25000 од. / 5 мл) і з пеніциліном (50 МО) і стрептоміцином (25 мг) на 500 мл середовища (при + 37 ° С). Під контролем бінокулярної лупи відбирали ворсини і їх фрагменти, відмивали від крові і поміщали у флакон з гіпотонічним розчином (5 мл) і колхицином (кінцева концентрація - 2,5 мкг / мл). Гіпотонічну обробку 0,9% розчином цитрату натрію здійснювали при кімнатній температурі або 35-40 хв. при +37 ° С. При префиксации видаляли піпеткою 2-3 мл гіпотонічного розчину, додавали по краплях такий же обсяг свіжоприготованого фіксатора (абсолютний метанол, оцтова кислота), струшуючи флакон, потім - струменево. Префіксація проводили 45-90 хв. при кімнатній температурі.
Для фіксації піпеткою видаляли весь префіксірующій розчин. У флакон з ворсинками наливали 4-5 мл холодного фіксатора. Фіксацію проводили 1-2 години при + 4 ° С. В чистий пеніциліновий флакон наливали 3-4 мл свіжого фіксатора, поміщали в нього ворсинки (2-3 мг) і додавали рівний об'єм дистильованої води. Через 2-5 хв., Коли ворсинки опускалися на дно, їх витягували пінцетом, висушували на фільтрувальному папері і переносили на чисте знежирене скло, підігріте над полум'ям спиртівки до + 40-50 ° С, в краплю 60% -ної оцтової кислоти. Мацерацию і вихід клітин спостерігали за допомогою инвертирующего мікроскопа. Через 3-5 хвилин, похитуючи скло, домагалися рівномірного розподілу суспензії на поверхні. Надлишок суспензії із залишками досліджуваного зразка переносили на наступне предметне скло. На препарат наносили 0,3-0,5 мл фіксатора, висушували.
Фарбування хромосом проводили стандартним GTG-методом. Препарати хромосом поміщали в 0,25% розчин трипсину на 10-30 с при кімнатній температурі, потім тричі промивали в етиловому спирті з концентрацією 70 °, 96 ° і 100 °, з експозицією не менше 30 з в кожному розчині. Отримані препарати висушували на повітрі при кімнатній температурі. Для забарвлення препаратів застосовували 5% розчин барвника Гимзе, приготованого на фосфатному буфері (рН 6,8). Процедура фарбування тривала 4-5 хв. Потім препарати промивали дистильованою водою і висушували на повітрі при кімнатній температурі.
Мікроскопічний аналіз метафазних пластинок проводили при збільшенні 1 000 с використанням мікроскопа Axioplan 2 фірми Zeiss. Відбір метафазних пластинок і аналіз хромосом здійснювали відповідно до загальноприйнятих критеріїв [6].
Отримані дані статистично обробляли за допомогою програми EXCEL.
Результати та їх обговорення
Середній вік пацієнтів груп I (33,98 ± 0,26 років) і II (33,59 ± 0,29 років), IА (30,94 ± 0,27 років) і II А (30,91 ± 0,26 років ), IБ (37,11 ± 0,21 років) і IIБ (37,25 ± 0,37 років) достовірно не відрізнявся, що дозволило надалі порівнювати отримані результати.
Цитогенетичний аналіз продуктів зачаття показав, що 46,25% (111/240) викиднів після запліднення in vitro і 67,00% (134/200) після природного зачаття мали аномальний каріотип (p <0,01) (рис.). Таким чином, частота самовільного переривання вагітності внаслідок аномалій каріотипу при природному зачатті була вища за таку при ІКСІ в 1,44 рази (ВШ = 2,36 ± 0,20, 95% ДІ: 1,60-3,48). Відомо, що аномалії каріотипу при втратах вагітності виникають через помилки в гаметогенезе, заплідненні і дробленні [1, 3-5]. Тому отримані дані можна пояснити тим, що при штучному заплідненні виконується відбір ооцитів, сперматозоїдів, ембріонів і проводиться передімплантаційна генетична діагностика. Ряд порівняльних досліджень підтвердив, що виключення при заплідненні in vitro анеуплоїдних ембріонів для переносу може поліпшити імплантацію, знизити рівень самовільних абортів і уникнути народження дітей з числовими хромосомними аномаліями після штучного запліднення [7].
Аналіз за віковими групами показав, що в групі жінок 35 років і старше частота хромосомних аномалій була вища за таку у осіб до 35 років при заплідненні in vitro в 1,63 рази (57,63% (68/118) проти 35,25% ( 43/122), p <0,01; ВШ = 2,50 ± 0,27; 95% ДІ: 1,48-4,21), а при природному зачатті достовірно не відрізнялася (75,61% (62/82 ) проти 61,02% (72/118), p> 0,05). Серед пацієнток молодше 35 років хромосомні аномалії при природному зачатті зустрічалися в 1,74 рази частіше, ніж при заплідненні in vitro (61,02% (72/118) проти 35,25% (43/122), p <0,01; ОШ = 2,88 ± 0,27; 95% ДІ: 1,70-4,86), а серед осіб 35 років і старше - в 1,31 (75,61% (62/82) проти 57,63% (68/118); p <0,03; ВШ = 2,28 ± 0,32; 95% ДІ: 1,22-4,25).
За даними літератури, вплив віку матері на каріотип плода обумовлюється наступними факторами: різні ушкоджують моменти, приховано збільшують частоту хромосомних аномалій в плодовому яйці; події, що відбуваються в гонадах плода, що впливають на профазних взаємодії між гомологічними хромосомами; тривала зупинка профази у жінок, що сприяє анеуплоїдії через віковий розпаду компонентів мейотического механізму; екологічні фактори, що впливають на кількох різних стадіях оогенезу і сприяють формуванню аномалій каріотипу [12].
А 
Б 
В 
Цитогенетичні дослідження ворсин хоріона: А - моносомія по Х хромосомі; Б - трисомія по хромосомі 13; В - трисомія по хромосомі 21
Серед виявлених аномальних кариотипов аутосомні трисомії склали серед викиднів після запліднення in vitro 75,68% (84/111) і після природного зачаття -58,96% (79/134) (p <0,01; ВШ = 2,17 ± 0 , 28; 95% ДІ: 1,25-3,77); множинні трисомії - відповідно 6,31% (7/111) і 4,48% (6/134) (p> 0,05); дісоміі Х - 2,70% (3/111) і 0,75% (1/134) (p> 0,05); моносомии Х - 4,50% (5/111) і 4,48% (6/134) (p> 0,05); моносомии 21 - 1,80% (2/111) і 0,75% (1/134) (p> 0,05); полиплоидии - 6,31% (7/111) і 21,64% (29/134) (p <0,01; ВШ = 4,10 ± 0,44; 95% ДІ: 0,41,72-9, 78); структурні хромосомні аномалії - 1,80% (2/111) і 7,46% (10/134) (p <0,05; ВШ = 4,40 ± 0,79; 95% ДІ: 0,94-21, 50); маркерная хромосома - 0,90% (1/111) і 1,49% (2/134) (p> 0,05). Таким чином, достовірними цитогенетическими особливостями викиднів після запліднення in vitro в порівнянні з такими після природного зачаття були: велика частота аутосомних трисомій в 1,28 рази і менша зустрічальність полиплоидией і структурних хромосомних аномалій відповідно в 3,43 і 4,14 рази.
Статистично достовірної різниці в розподілі частот аномальних кариотипов серед викиднів від жінок молодше і старше 35 років як після запліднення in vitro, так і після природного зачаття не виявлено, що збігається з даними [2]. Зареєстровані деякі особливості частоти народження трисомій в залежності від віку: серед досліджуваних пацієнток з викиднями після запліднення у жінок до 35 років найбільш часто зустрічалися у напрямку зниження трисомия 13, 22, 15 і множинні трисомії, а у жінок 35 років і старше - трисомія 16, 15, 22, 21; серед випробовуваних з викиднями після природного зачаття у жінок до 35 років найчастішими трисомиями у напрямку зниження були: трисомія 16, 13, 18 і 21, а у жінок 35 років і старше - 16, 22, 15, 13 і 18.
висновки
Частота викиднів після запліднення in vitro з аномальним каріотипом зустрічається рідше в порівнянні з такими при природному зачатті в 1,44 рази. Аутосомні трисомії представляють найбільш поширені хромосомні аномалії викиднів як після запліднення in vitro, так і після природного зачаття. Відмінними рисами викиднів після запліднення in vitro в порівнянні з такими після природного зачаття є велика частота аутосомних трисомій в 1,28 рази і менша зустрічальність полиплоидией і структурних хромосомних аномалій відповідно в 3,43 і 4,14 рази. У групі жінок 35 років і старше частота хромосомних аномалій вища за таку у пацієнток до 35 років при заплідненні in vitro в 1,63 рази, а при природному зачатті достовірно не відрізняється.
бібліографічна посилання
Дубініна В.Г., Носенко О.М., Головатюк Е.П., Макшаева Е.Т., Пацкова А.І., Косюга О.Н. Цитогенетичний ОСОБЛИВОСТІ ПОВТОРНИХ викидень ПІСЛЯ ЗАПЛІДНЕННЯ IN VITRO І ПРИРОДНОГО ЗАЧАТТЯ ВІД ЖІНОК РІЗНОГО ВІКУ // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2016. - № 3 .;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=24457 (дата звернення: 08.06.2019).
Пропонуємо вашій увазі журнали, що видаються у видавництві «Академія природознавства»
(Високий імпакт-фактор РИНЦ, тематика журналів охоплює всі наукові напрямки)
Ru/ru/article/view?