Продуктивність SPRI і нано-SPRI (SPRI, що використовують NanoEnhancers) порівнювали з ELISA для виявлення рчГР в складному середовищі. Відмінності в установці цих методів описані тут коротко. Для SPRI (з прямим детектуванням, рис 1), захоплення антитіла, иммобилизованного на поверхні, а потім пробу вводять і зв'язування аналіту до поверхні датчика вимірюється безпосередньо в реальному часі і етикеткою вільній формі. Проте, з нано-SPRI (рис 1), після того, як аналіт зв'язується з поверхнею датчика, послідовне впорскування слід з квантовими точками, покритих антитілами виявлення для посилення сигналу SPRI.
Малюнок 1. Схематичне представлення порівняння прямий режим (SPRI) і посилений режим (Нано-SPRI) виявлення рчГР в С грубі зразки. ліганди (рчГР або IgG антитіла) конкретні іммобілізація в форматі масиву на биочипа SPRI. Білка-мішені (рчГР) шипами в сироватці крові людини, введеного на поверхню датчика безпосередньо виявлено (SPRI) і послідовно виділені NanoEnhancers (Нано-SPRI). Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Що стосується ELISA, як ямкові планшети прибувають вже попередньо функціоналізованих імобілізованим антитілом, а потім зразок вводять, інтерес аналіту зв'язуються. Антитіла виявлення вводиться з подальшим підкладки того. Оптичну щільність потім вимірювали при 450 нм. У цьому дослідженні, комерційний набір ELISA (фіг.2) був використаний для вимірювання рчГР шипами в 10% сироватці людини.
8 / 53508fig2.jpg "/>
Малюнок 2. Схематичне представлення процедури аналізу ELISA. рчГР білок (сині овали) вводиться в лунки, які були попередньо функціоналізованих з моноклональними антитілами (жовтий), специфічних для рчГР. Неспецифічних взаємодій усуваються шляхом промивання свердловин промивання буфером з подальшим введенням антитіла виявлення prefunctionalized з пероксидазою хрону (HRP, фіолетовий). Рішення буде змінити колір після додавання субстрату тетраметилбензидину (ТМВ, золото). Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Малюнок 3 являє кривої титрування рчГР шипами в 10% сироватці людини і представлений в залежності від отриманого OD при 450 нм. Хороший лінійний відгук спостерігалося, а межа виявлення був визначений як 1 нг / мл. Коефіцієнт вартельная (CV) склав 6,5% свідчить хорошу відтворюваність.
Малюнок 3. ІФА аналіз даних. Концентрація рчГР шипами в сироватці крові в змові проти отриманого ОД при 450 нм. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Далі, виявлення рчГР шипами в сироватці людини оцінювали за SPRI. Пряма реєстрація рчГР призвело з відповідним градієнтом концентрації кривої (рис 4), кожна точка являє собою середнє значення різниці відбивної розрахованої за три SPRI кінетичних кривих для кожної концентрації. Межа виявлення (LOD) був визначений як 3,61 нг / мл. SPRI аналіз пряме виявлення було добре відтвореним як CV в аналізеТолько 4,1%.
Малюнок 4. Виявлення Пряма SPRI чГР шипами в 10% сироватці людини. Отриманий нормалізовані SPRI кінетичної ділянку після ін'єкції різних кількостей чГР шипами в сироватці людини з наступною ін'єкцією буфер з високим вмістом солі (пунктирна лінія) по вертикалі для видалення не -специфічні взаємодії. Градієнт концентрації Крива зв'язування різних кількостей гормону росту шипами в сироватці крові людини на поверхню датчика, який був prefunctionalized з біотінілірованние чГР-специфічних антитіл. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Для збільшення чутливості сенсора SPRI, NanoEnhancers (КТ заздалегідь функціоналізованих антитіл виявлення) послідовно вtroduced на поверхню датчика, для того, щоб підкреслити наявність рчГР шипами в сироватці крові людини. Після вирахування фону, NanoEnhancers змогли посилити реакцію біосенсора до 7,9%, проте, з мінімальним зміною сигналу (Імуноглобулін G (IgG) -специфічні антитіл, зміна відбивної 0,38%; рис 5 на контрольованих регіонах інтерес Візуалізація. Поверхню датчика показав, що тільки регіони, які мають інтерес рчГР-специфічних антитіл з іммобілізованим випробувати великий зміна контрастності підтверджує безпосередньо з кінетичної відповідь сенсограмми.
Малюнок 5. Виявлення рчГР з використанням сендвіч-аналіз шипами в 10% сироватці людини. SPRI кінетичної ділянку після ін'єкції рчГР (30 нг / мл) в буфері (10 мМ PBS, 150 мМ хлориду натрію, рН 7,4) на попередньо -functionalized чіп з 11-меркаптоундекановой кислоти / rhGH-специфічне антитіло IgG і контролювати-антитіло потім блокували БСА з подальшим додаванням виявлення покритих антитілами квантових точок (NanoEnhancers). Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї постаті.
Щоб продемонструвати доцільність біосенсора Nano-SPRI, оцінювали діапазон виміру рчГР в сирих зразків. Розширений робочий діапазон від 30000 пг / мл до 0,25 мкг / мл призводило у відповідь на додавання NanoEnhancers (рис 6). Варто зазначити, що кожна точка на кривій титрування усредняется з трьох незалежних експериментів. Отже, нижня межа виявлення була розрахована на 9,20 пг / мл, а коефіцієнт варіації склав 20%.
Малюнок 6. Виявлення Нано-SPRI чГР шипами в сироватці крові людини. Нормована SPRI кінетична уявлення ділянку hGH_specific_Anti-КТ-посиленого сигналу для зразків сироватки крові людини з шипами з різними концентраціями гормону росту. Вертикальна пунктирна лінія (сірий) являє собою точку впорскування працює буфера. (Б) Градієнт концентрації Крива зв'язування NanoEnhancers (hGH_specific_Anti-КТ) після ін'єкції різних кількостей гормону росту шипами в сироватці людини на поверхню датчика, який був prefunctionalized з 11-меркаптоундекановой кислоти / ГР конкретних антитіл. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Далі, зміна, яке відбувається в відбивної кривої SPR залежно від концентрації порівнювали між прямою і методом біоаналіза NanoEnhancer (фіг.7). Для прямого деТехніка СЕРЕДОВИЩА між 25 і 0,25 пг / мл, сигнал початку плато, і це не дивно, так як ці концентрації падають нижче LOD 3 нг / мл (малюнок 7). Аналогічно, для посиленого техніки, концентрації нижче LOD 9,2 пг сигнал / мл почали плато і не показали практично не зміни.
Малюнок 7. Порівняльний аналіз SPRI з нано-SPRI. Ця гістограма показує процентну зміну в відбивної (% R) після введення рчГР шипами в сироватці крові людини (пряме виявлення), а потім за допомогою ін'єкції NanoEnhancers (посилений) для виявлення 30000 пг / мл, 250 пг / мл, 25 мкг / мл, 2,5 мкг / мл і 0,25 мкг / мл. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
(Рисунок 8). Однак, коли рчГР шипами в зразку сироватки вводили в тому ж місці, функціоналізованих антитіл рчГР, посилення сигналу спостерігалося. На закінчення, платформа нано-SPRI продемонструвала відмінну специфічність і вибірковість щодо рчГР.
Малюнок 8. Оцінка Нано-SPRI селективності по відношенню до рчГР. Біодатчик відповідь Нано-SPRI після ін'єкції рчГР (чорний) і IGF-1 (червоний) в ссогнувшісь в сироватці. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Кореляційний аналіз проводили з використанням коефіцієнт кореляції Пірсона для визначення кореляції між інтенсивністю сигналу SPRI і ELISA значень оптичної щільності (малюнок 9). Р-значення <0,01 вважали значущим. Як показано на цьому графіку, існує хороша кореляція між рівнями рчГР в шипами людської сироватки, виміряних SPRI і ELISA. R-значення було 0,9263 за 9 різних зразків.
Малюнок 9. Кореляція Пірсона аналіз між ELISA і Nano-SPRI. Сюжет співвідноситься інтенсивність сигналу Нано-SPRI (Y-вісь) з ELISA оптичної щільності (вісь х) значень. (Грушина коефіцієнт кореляції п = 9, R = 0,9263, р = 0,00000183). Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Рівновага константа дисоціації (KD) визначали, використовуючи GraphPad Software для ELISA. Обчислення значення Уб була приблизно 79 нМ (таблиця 3). В на (К а) і від (KD) ставки не може бути визначена за допомогою ELISA. Проте, за допомогою програмного забезпечення для аналізу даних, метод пряме виявлення призвело з KD значення в 23 годин, використовуючи молекулярну масу 22 кДа, що відповідає одній молекулі рчГР. Включення і виключення ставок були обчислені 6.1 x10 7М -1 з -1 і 1,33 × 10 -3 с -1, відповідно. Це по суті переводить, що 0,13% від розпаду рчГР і антитіло в секунду. Що стосується Amplified SPRI експеримент, поліпшити загальну взаємодію спостерігалося між NanoEnhancers і рчГР як розрахункової аффинностью зв'язування було визначено в 4:03 вечора. Крім того, сильніший швидкості асоціації спостерігалося NanoEnhancers і рчГР ніж імобілізованим антитілом / рчГР, проте швидкість дисоціації показує, що 0,26% від NanoEnhancer / рчГР / Capture розпаду антитіл в секунду.
МетодУб (Affinity)До а (ставка по)До д (від швидкості)ЛОДІФА 79.45 х 10 -9 М Чи не Доступно Чи не Доступно 1 нг / мл SPRI 23.2 х 10 -12 М 6,1 х 10 7М -1 з -1 -3 с -1 3.61 нг / мл Нано-SPRI 4.33 х 10 -12 М 7,54 x10 8М -1 з -1 2.62 x10 -3с -1 0,0092 нг / мл
Таблиця 3. Повний кінетичний аналіз даних. Оцінка спорідненості, на швидкості і швидкість дисоціації з імунних реакцій з використанням GraphPad (ELISA) та аналіз даних програмного забезпечення (SPRI і нано-SPRI). Визначення авідності допомогою молекулярну масу 22 кДа, що відповідає одній молекулі рчГР був обраний. Межі виявлення були визначені для всіх трьох досліджень з використанням Excel.
