Хірургії та ін'єкцій техніка прості для виконання як тільки освоїв, вимагаючи не основного обладнання або дорогих матеріалів. Якщо нової для операцію нирки фланг розріз, один навчальний день на кількох мишей, запланованих для евтаназії повинні бути дозволені в якому мишей, які не відновлених після операції тому, що перша спроба ця операція може зайняти набагато більше часу, ніж зазвичай. Крім того слідчі знайомі з аналогічними методами можуть знайти його досить проста. Ретельно дотримуйтесь ілюстрації на малюнку 1 і мальовничих напрямків на малюнку 2. Щоб правильно розмістити розріз, хірург можна використовувати пальці наполягати на миші шлунок, поки вона лежить на його стороні. Нирки візуалізується на невеликий шматок, який піднімається поблизу хребта з ніжним внутрішньочеревного тиску, і розріз повинен проводитися над цій галузі (рис. 1 і рис. 2). Важливо зробити розріз через шари шкіри і м'язів правильний розмір (рис. 1). Якщо розріз є занадто великою, нирки буде легко ковзати по назад в черевній порожнині, ускладнюючи ін'єкцій. Якщо розріз занадто малий, це буде важко натиснути нирки з черевної порожнини і пошкодження органів може статися. Іншим важливим моментом є розміщення голки в ниркової миски. Хірург повинен натисніть нирки з закритими щипцями, а потім вставити голку в ниркової балії кутом паралельно на робочій поверхні такі що велика частина обсягу уприскування переходить безпосередньо ниркової паренхіми (рис. 2). Важливо, що ін'єкції виконуватися як можна змусити гідродинамічні тиску, необхідного для нирок трансфекції швидше.
Мишей різних штамів, віку, ваги та статі матиме відмінності в положенні нирки і кількість жиру навколо нирки, тому деякі коригування можуть бути необхідні для роботи з мишей інтерес. Якщо можливо перша спроба хірургічні, з якого відновлюються мишей повинні являти собою негайне індикація експресії генів нирки конкретним, наприклад люціферази зображень (рис. 3A). Якщо використовуються молодих мишей, очікуваний результат дорівнює у всіх мишей сяйво, яка знаходиться в межах одного порядок величини (рисунок 3B). Іноді навіть після другої ін'єкції люциферин, очевидно, візуалізації, що миша або мишей не стати transfected на рівні, порівнянному з іншими або що деякі вводять мишей навіть повністю відсутні в експресії генів. Такі миші можуть бути виключені з дослідження через невдалі трансгени доставки. Якщо багато хто з мишей відсутність експресії генів, хірург повинен зменшити час ін'єкції розчину ДНК. Нездатність викликати необхідні шкоди через високий тиск упорскування є найбільш імовірним винуватцем послідовне відсутність експресії генів. Миша повинна бути ретельно контрольованих після операції для потенційних проблем зі здоров'ям (див. Таблицю 1 потенційні проблеми зі здоров'ям із супроводжуючою рішення і консультуватися з командою ветеринарні установи при необхідності). Після періоду початкової підготовки сама операція слід прийняти менш ніж за 10 хв. Хірургічне період повинні бути зроблені якомога коротше працює на одній миші одночасно, щоб запобігти всихання тканин під час операції. Велику частину часу інвестиції в цій процедурі пояснюється індукції і відновлення від анестезії Ксілазіна кетаміну. Два досвідченого персоналу, які працюють в команді слід очікувати виконання до 10 операцій в день, з п'ятнадцять як розумний максимум.
Дослідники повинні очікувати невелику кількість клітин пляма досить позитивним для трансгени протягом перших кількох днів після ін'єкції. Ці позитивні клітини будуть локалізовані в прилеглих районах, де впорскування рідини проникли нирок (рис. 3 c -D) патчі. Деякі частини нирок буде повністю негативним для transfected клітин. Такі негативні районах буде також потребуватиме еритроцитах і мають цілком нормальна гістологія, так як ін'єкції не вдалося досягти цих районів. Плямуючи протоколи і промоутерів повинні ретельно оптимізовані захопити експресії генів. Слідчі повинні очікувати, що клітини, які типи transfected буде змінної, високі рівні вираження гена в низький відсоток transfected клітин, і Локалізація білків усередині клітини не можуть бути як очікувалося через високого рівня вираження (рис. 3D).
Малюнок 3. Гідродинамічні ниркової балії ін'єкції призводить до експресії генів нирок конкретних люціферази і TdTomato. (A) FVB 7-8 тижні старих самців мишей були ін'єкції гідродинамічні ниркової балії 20 мкг pTEeL, висловлюючи плазмида Покращено люціферази Світлячок від EF-1α промоутер. Мишей, 2, 3 і 5 також вводили з 20 мкг флуоресцентні репортер плазміди. (B) точка ділянку сяйво, отримані від мишей, показано в (A). (C і D) Мишей було дано або гідродинамічних доставки буфер тільки (C) або (D) флуоресцентних мікросфери (яскраві зелені точки) і pEF1α-TdTomato, висловлюючи червоних флуоресцентних репортер TdTomato від EF-1α промоутер. Проксимальних канальців були заплямована Lotus tetragonolobus агглютінінов (LTA; зелений) і transfected клітин показуються після фарбування з анти RFP антитіла для того щоб посилити сигнал TdTomato (червоний). Ядра є заплямована DAPI (синій). Зображення показані в (C) і (D) є 13,2 мм x 17,5 мм. похибок представляють Ефективне значення помилка середнього значення. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
