ПЛР-аналіз: метод діагностики, які виявляються інфекції

1. У чому суть полімеразної ланцюгової реакції?
2. Достоїнства і недоліки
3. Чого «боїться» ПЛР, що вона вміє і як до неї підготуватися?
4. Як правильно підготуватися, щоб отримати достовірний результат?
5. ПЛР може працювати в будь-який біологічної середовищі
6. Хвороби і застосування ПЛР
7. ПЛР і гепатити
8. Папіломовірусна інфекція
9. Інші ІПСШ та TORCH-інфекції
10. ПЛР - головний метод виявлення прихованих інфекцій

ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція) - досягнення молекулярної біології, одна з головних методик клінічної лабораторної діагностики кінця 20-го і початку 21-го століть, що приносить величезну користь в різних областях медичної науки.

Багато людей плутають її з ІФА (імуноферментний аналіз) , Що, в общем-то, зрозуміло. Вони в чомусь схожі, оскільки виконують одну задачу - пошук причини патологічних станів, обумовлених проникненням в організм людини інфекційних агентів. Однак між ними є й відмінності. ІФА, наприклад, шукає сліди перебування мікроорганізмів, тобто, антитіла (АТ) , А ПЛР знаходить «святая святих» збудника - ДНК або РНК (нуклеїнові кислоти), що дають життя чужим людському тілу мікроскопічним істотам.

Методам ПЛР доступні нуклеїнові кислоти «ворога», що знаходяться у всіх біологічних рідинах і тканинах організму, а тому цей аналіз не зобов'язує використовувати в якості дослідження тільки венозну кров, можна взяти слину, виділення зі статевих шляхів, мокроту або інше середовище, яка несе інформацію про захворювання. Вибір матеріалу для дослідження залишається за лікарем, який передбачає ту чи іншу патологію і знає, яке середовище в таких випадках більш інформативна.

У чому суть полімеразної ланцюгової реакції?

ПЛР-дослідження - це досягнення і величезна заслуга молекулярної біології. Це - метод, який, виявивши мікроділянки ДНК або РНК чужорідного генетичного матеріалу (геному), здатний розпізнати індивідуальні характеристики, властиві тільки одному виду мікроорганізмів, що не сплутавши його з жодним іншим. Як же працює метод ПЛР і як йому вдається відновити картину поведінки інфекційної клітини в живому організмі?

процес проведення ПЛР

Отже, фрагмент нуклеїнової кислоти знайдений, але він один і для проведення реакції його явно недостатньо, тому він кодується (копіювання). Однак для подальшого процесу необхідна велика кількість таких мікроучастков, що може забезпечити його розмноження шляхом добудовування нових, ідентичних знайденому фрагменту, ділянок ДНК (реплікація). Розмноження є природним і невід'ємним властивістю нуклеїнової кислоти, яка буде реплицироваться за допомогою ферменту полімерази навіть поза живим організмом (в пробірці з пробою), утворюючи безліч клонів, тобто, піде ланцюгова реакція. Клонувати будуть все нові і нові фрагменти, але тільки ті, в яких зацікавлений дослідник. Ось чому так важливо взяти «чистий», без сторонніх домішок аналіз, а тест проводити дуже акуратно.

З огляду на перелічені здатності полімеразної ланцюгової реакції, можна здогадатися, чому вона так легко відрізняє уреаплазму від мікоплазми , Або кожну з них від хламідії .

Таким чином, навіть якщо серед мільйонів клітин людського організму загубиться не саме живий вірус, а лише частка його ДНК, то ПЛР, якщо їй ніщо не завадить, мабуть, впорається із завданням і повідомить про перебування «чужака» позитивним результатом. В цьому суть ПЛР і її основна перевага.

Достоїнства і недоліки

До лабораторії, що здійснює ПЛР-діагностику, пред'являються високі вимоги в плані обладнання, тест-систем та кваліфікації медичного персоналу. Це високотехнологічна лабораторія, що володіє арсеналом високочутливих і високоспецифічних реагентів, тому особливих недоліків вона не має. Хіба що видає позитивний результат при відсутності клінічних проявів і тим самим ставить лечебника перед дилемою: чи варто починати лікування чи ні?

Лікар, що спостерігає пацієнта, починає сумніватися в достовірності результатів тестування, оскільки ніяких ознак захворювання не бачить. Але все ж, з огляду на високу чутливість ПЛР-системи, слід пам'ятати, що вона виявляє збудника навіть в доклінічній стадії, а позитивний результат в такому випадку є швидше перевагою, ніж недоліком. Виходячи з цього, лікуючий лікар повинен сам прийняти рішення про доцільність терапії, взявши до уваги і інші аргументи «за» і «проти».

Переваги діагностики за допомогою полімеразної ланцюгової реакції очевидні:

• Висока специфічність, що досягає 100%, обумовлена присутністю в відібраному зразку частинок нуклеїнових кислот, властивих конкретному організму, але чужорідних людині;
• Висока продуктивність, адже ПЛР - високотехнологічна автоматизована методика, що надає можливість проведення тестування в день забору матеріалу і позбавлення, таким чином, пацієнта від зайвих хвилювань;
• ПЛР, працюючи над однією пробою, здатна провести кілька досліджень і про бнаружіть кілька збудників, якщо їй буде таке завдання. Наприклад, при діагностиці хламідійної інфекції, де ПЛР відноситься до основних методів, поряд з хламидией, можна виявити і Нейссер (гонокок) - збудник гонореї . Причому, на достовірності результатів це негативно не позначається;
• Тестування методом ПЛР ви являє небезпечні мікроорганізми в інкубаційному періоді, коли вони ще не встигли завдати відчутної шкоди організму, тобто, рання діагностика попереджає про прийдешнє розвитку патологічного процесу, що дає можливість підготуватися до нього і прийняти у всеозброєнні.

Крім цього, щоб уникнути непорозумінь, іноді виникають при діагностиці, ПЛР захищає себе ще й тим, що її результати можуть зафіксуватися (фотографія, комп'ютер) з метою використання їх в експертних цілях, якщо буде на те необхідність.

Нормою в відповідях ПЛР вважають негативний результат, який вказує на відсутність фрагментів чужорідних нуклеїнових кислот, позитивну відповідь буде свідчити про наявність інфекції в організмі, цифрові значення означають стан вірусу і його концентрацію на момент тестування. Однак повну розшифровку аналізу здійснює лікар, який пройшов спеціальне навчання по темі «ПЛР». Намагатися ж інтерпретувати результати самостійно не має ніякого сенсу, оскільки можна, що швидше за все і станеться, неправильно зрозуміти і почати заздалегідь хвилюватися.

Чого «боїться» ПЛР, що вона вміє і як до неї підготуватися?

Як в будь-яких інших дослідженнях, іноді результати тесту виявляються хибнопозитивними або помилково негативні, де ПЛР винятком не є. Подібне може відбуватися в випадках:

1. Порушення технологічного процесу на одному з етапів реакції;
2. Недотримання правил забору матеріалу, його зберігання або транспортування;
3. Присутність сторонніх домішок в матеріалі.

Це говорить про те, що до ПЛР - діагностики інфекцій потрібно підходити уважно, обережно і акуратно, інакше зразки матеріалу можуть поміняти свою структурну будову або зовсім зруйнуватися.

Етапи ПЛР-діагностики. Помилкові результати можуть дати порушення на будь-якому з етапів дослідження

ПЛР-діагностика інфекцій відноситься до категорії «золотих стандартів» серед інших лабораторних методів, тому її можна застосувати для пошуку збудників багатьох захворювань, на перший погляд не мають нічого спільного між собою:

• Туберкульоз різної локалізації, пневмонія (в тому числі і атипова, викликана хламідіями);
• Дитячі інфекції (корова краснуха, паротит, кір);
• дифтерія;
• сальмонельоз;
• Зоонозна інфекційна хвороба - лістеріоз (захворювання характеризується різноманіттям симптомів з ураженням лімфовузлів, ЦНС, внутрішніх органів);
• Захворювання, обумовлені проникненням вірусу Епштейна-Барр (інфекційний мононуклеоз та ін.);
• Онкологічна патологія, спровокована папіломовірусною інфекцією (ВПЛ і його типи);
• Бореліоз (хвороба Лайма, кліщовий енцефаліт);
• Гелікобактерна інфекція, збудником якої є проживаючий в шлунку людини мікроб Helicobacter pylori. Доведено, що хелікобактер стає причиною розвитку раку шлунка або 12-палої кишки;
• кандидоз і практично всі ЗПСШ .

ПЛР-діагностика інфекцій, що передаються статевим шляхом, має особливу значущість, оскільки захворювання, викликані таким чином, часто тривалий час протікають без яких би то не було клінічних проявів, зате при вагітності починають активізуватися і, таким чином, загрожувати здоров'ю і навіть життю дитини. Аналогічно поводяться і TORCH- інфекції . Деякі з них ( «торч») відносяться одночасно і до ІПСШ, тому останні вимагають більш докладного розгляду. Ознайомитися з найпопулярнішими методиками читач зможе в наступних розділах статті.

Як правильно підготуватися, щоб отримати достовірний результат?

Відразу зауважимо, що підготовка до ПЛР досить проста, ніяких особливих зусиль з боку пацієнта не вимагає. Потрібно лише виконати три нескладних завдання:

1. Не мати статевих контактів за 24 години до того, як здати аналіз;
2. Для забору і аналізу крові з вени потрібно прийти на голодний шлунок, пити, до речі, теж не можна;
3. Здати сечу слід нічну (вранці - в стерильну баночку, придбану напередодні в аптеці).

ПЛР може працювати в будь-який біологічної середовищі

Метод ПЛР не відрізняється «ненажерливістю», тому сприймає будь-яку біологічне середовище, що містить передбачуваний інфекційний агент.Обично вибір - що потрібно взяти для дослідження, залишається за лікарем.

Таким чином, в пошуках збудника, крім аналізу крові (хоча він теж підходить і в більшості випадках береться паралельно іншого матеріалу), можна використовувати:

• мазок (Виділення урогенітального тракту);
• Зішкріб слизових ротової порожнини, кон'юнктиви, носоглотки, статевих шляхів (у жінок беруть з шийки матки і піхви, у чоловіків - з уретри);
• слину;
• сперму;
• Сік передміхурової залози;
• Тканини плаценти і амніотіотіческую рідина (навколоплідні води);
• Осад сечі (після центрифугування), наприклад, для виявлення деяких ІПСШ та мікобактерій туберкульозу;
• Мокротиння і плевральну рідину з тією ж метою;
• ексудати;
• Спинномозкову рідину при підозрі на інфекційне ураження ЦНС;
• Біопсійний матеріал (біоптат), взятий з печінки, 12-палої кишки, шлунка та ін.

До вищепереліченого хочеться додати, що матеріалу для тестування у всіх випадках, навіть в зіскрібків і виділеннях, буде досить, так як тестування методом ПЛР великих обсягів не вимагає, аналізу вистачає і декількох мікролітрів, які зазвичай беруть в мікропробірку типу «Еппендорф» і відправляють на дослідження.

Хвороби і застосування ПЛР

ВІЛ і полімеразна ланцюгова реакція

Зазвичай при проходженні анонімного обстеження в разі позитивних результатів иммуноблотинга, діагностику ВІЛ-інфекції повторюють заново. Якщо діагноз підтверджується, пацієнтові призначають додаткові дослідження:

1. Визначення за допомогою імунологічних реакцій абсолютних значень кількості лімфоцитів CD4 (імунокомпетентні клітини - Т-хелпери або помічники), які інфекція вражає в першу чергу, після чого вони втрачають свої основні властивості і не можуть відрізнити «своє» і чуже ». Циркулює в плазмі крові РНК вірусу вони приймають за нормальні клітини організму і не реагують на них;
2. Виявлення РНК вірусу методом ПЛР і розрахунок концентрації вірусних частинок з метою встановлення стадії, тяжкості патологічного процесу і прогнозу з урахуванням цих даних. Зрозуміло, слово «норма» в цьому плані не існує, оскільки реакція завжди позитивна, а розшифровка цифрових значень знаходиться в компетенції лікаря.

ПЛР і гепатити

Методом ПЛР можна виявляти збудників гепатитів , Найчастіше тест використовується для діагностики З гепатиту, який погано визначається іншими методами.

Вірус гепатиту С (РНК-) за своєю поведінкою в організмі людини нагадує ВІЛ. Вклинюючись в геном клітин печінки (гепатоцитів), він перебуває там в очікуванні свого часу, який може наступити хоч через 2 роки, хоч через 20 років, тому медики прозвали його «ласкавим вбивцею». Гепатит С призводить до формування злоякісного процесу в печінковій паренхімі, який проявляється на пізніх стадіях. Всі ці події імунна система не помічає, приймаючи вірус за гепатоцит. Правда, антитіла до вірусу в деяких кількостях виробляються, проте вони не забезпечують гідний імунну відповідь. Для діагностики ІФА на гепатит С не дуже інформативний, оскільки вказує на те, що вірус залишив сліди, а пішов сам - невідомо. При ВГС відомі випадки самолікування, в той час як антитіла проти вірусу залишаються і продовжують циркулювати довічно (імунологічна пам'ять). ПЛР помітно випереджає утворення антитіл і може виявити вірусну частку вже через 1-1,5 тижні, в той час як АТ можуть з'явитися в інтервалі від 2 місяців до півроку

ПЛР-діагностика в разі підозри на розгул вірусу гепатиту С в організмі людини є найбільш оптимальним методом дослідження, бо тільки вона здатна розпізнати присутність «ласкавого ворога» в крові або біоптаті печінки пацієнта.

Однак іноді мають місце випадки, коли АТ позитивні, а результат ПЛР - негативний. Таке іноді відбувається при дуже низькій кількості вірусу або при його «пасивному» стані в печінці без виходу в кров'яне русло. Щоб все-таки знайти істину, у пацієнта беруть повторний аналіз, а то й не один.

Папіломовірусна інфекція

ВПЛ (вірус папіломи людини) , Якщо не відбудеться самоизлечение, теж може, нічим себе не проявляючи, довго персистувати в організмі господаря, який про це навіть не підозрює, оскільки ПЛР зробити не доводилося, а симптоми хвороби були відсутні. Однак наявність папіломовірусною інфекції, нехай і латентної, далеко не байдуже для здоров'я людини, де особливу небезпеку несуть певні типи вірусу, які викликають онкологічні захворювання (типи 16, 18).

Найчастіше від ВПЛ страждає жіноча половина населення, так як вірус більше любить жіночу статеву сферу, а особливо - шийку матки, де деякі типи вірусів сприяють розвитку диспластичних процесів, а потім і раку шийки матки, якщо не лікувати дисплазію і дати волю вірусу. Так ось, полімеразна ланцюгова реакція виявить вірусну ДНК, а потім вкаже «поганий» або «хороший» (онкогенний або Неонкогенні) тип оселився в організмі жінки.

Інші ІПСШ та TORCH-інфекції

Очевидно, що полімеразна ланцюгова реакція може знайти будь-яку чужорідну структуру, що складається з нуклеїнових кислот, а тому цей тест підходить для виявлення всіх ЗПСШ і TORCH-інфекцій, проте, він далеко не завжди використовується. Навіщо, скажімо, проводити такі дорогі дослідження для виявлення трихомонади або гонококка, якщо є більш доступні і дешеві?

TORCH-інфекції та ІПСШ настільки взаємопов'язані, що, часом, важко визначити, до якої групи слід віднести той чи інший збудник. У них взагалі буває складно розібратися, так як це досить різноманітні групи мікроорганізмів, які можуть передаватися статевим шляхом завжди або тільки за певних умов (імунодефіцит), а можуть представляти інтерес лише при вагітності, з огляду на можливу негативного впливу на її перебіг і на плід.

ПЛР - головний метод виявлення прихованих інфекцій

В основі розвитку клінічних проявів лежать різні збудники, знайти які буває під силу тільки ПЛР, що і є її основним завданням іноді спільно з ІФА, а іноді в якості єдиного підтверджуючого тесту, особливо, якщо симптоматика захворювання відсутня. Таку непросту ситуацію може створювати полімікробна інфекція, яка, крім явних збудників, включає ще й умовно-патогенні.

У чоловіків, які страждають запальними захворюваннями статевої сфери, наприклад, уретритом , Часто виявляють хламідії, уреаплазму і мікоплазму. Ці ж види несуть небезпеку і жіночому організму. Ті, хто знає підступність хламідії і стикався з нею, напевно пам'ятають, як важко буває її знайти і розпізнати, тому аналізу, зробленому методом ПЛР на хламідії, особливо довіряють, адже сховався в клітці дуже маленьких розмірів паразит веде себе обережно, а шкоди завдає завжди нишком.

Уреаплазма часто розглядається в парі з мікоплазмою. І це неспроста. Дані види, як і хламідії, не відносять ні до вірусів, ні до бактерій, вони проживають всередині клітин і відносяться до ІПСШ, хоча їх присутність в здоровому організмі теж далеко не рідкість. Так ось, щоб відрізнити здорового носія від хворої людини, потрібні особливі методи, де ПЛР вважається найбільш надійним, оскільки, зважаючи на особливості будови і поведінки цих мікроорганізмів, інші дослідження виявляються неефективними.

Що стосується вірусу герпесу (тип 1, 2) і цитомегаловірусу , Який теж відноситься до герпесвірусів (тип 5), то тут теж ситуація неоднозначна. Інфікованість населення земної кулі наближається до 100%, тому в даному випадку дуже важлива ідентифікація вірусу і його доза, що особливо грає роль при вагітності, адже дорослій людині, вірус, що прижився в його організмі, часто не доставляє ніяких турбот і ознак захворювання не дає.

Тому не слід ігнорувати призначене лікарем подібне обстеження, адже в деяких випадках полімеразна ланцюгова реакція є обов'язковим і необхідним методом лабораторної діагностики, здатним захистити від серйозних ускладнень не тільки жінку, а й маленького, ще не народженої, чоловічка.

На закінчення хочеться відзначити, що такий чудовий метод, як ПЛР, ось уже понад 30 років служить людству. При цьому, завдання тесту не обмежуються пошуком збудників інфекційних захворювань. Полімеразна ланцюгова реакція, породжена на грунті молекулярної біології, нерозривно пов'язана з генетикою, вона успішно застосовується в криміналістиці для ідентифікації особи, в судовій медицині для встановлення батьківства, в ветеринарії, якщо клініка для тварин має можливості купувати дороге обладнання, а також в інших сферах ( промисловість, сільське господарство та ін.).

Відео: ПЛР - суть і застосування