Спосіб виділення антибіотика гентаміцину

Спосіб дозволяє вдосконалити виділення і очищення антибіотика гентаміцину. Для цього сорбент контактують з ферментаційної рідиною протягом не менше 4 год в сорбційно-промивному апараті, після чого через катионит пропускають спочатку 0,03 - 0,045 н. розчин аміаку зі швидкістю 6 - 10 мл / г ч, потім 2 н. розчин аміаку за 4 - 5 ч. 1 мул.

Винахід відноситься до області медичної промисловості, конкретно стосується удосконалення способу виділення антибіотика гентаміцину.

Гентаміцин є сумішшю (гентаміцин C-комплекс), що складається з трьох основних компонентів C1a; C2; C1, зміст яких в комплексі строго нормовано (згідно кодексу Федеральних правил США FDA-78 вміст C1a - 15 - 40%; C2 - 20 - 50%; C1 - 25 - 50%). В процесі біосинтезу гентаміцину в ферментаційної рідини поряд з його основними компонентами продукуються подібні з ним родинні домішки - мінорні компоненти, які супроводжують цільовим продукту при його вилученні з цієї ферментаційної рідини. Зміст мінорних компонентів в готовому препараті гентаміцину в залежності від способів очищення досягає 5 - 30%. Видалення цих домішок з комплексу гентаміцину необхідно внаслідок можливих небажаних властивостей цих домішок і їх низької біологічної активності. Крім того, присутність в препаратах гентаміцину мінорних компонентів не дозволяє отримати цільове речовина зі стандартними якісними характеристиками. Відділенню цих домішок від основного комплексу гентаміцину, пов'язаного з великими труднощами, присвячений ряд досліджень. Відомі способи очищення комплексу гентаміцину шляхом сорбції з нативного розчину - відфільтрованої ферментаційної рідини, десорбції мінеральної кислотою, осадженням гентаміцину з елюата органічним розчинником. Отриманий сирець гентаміцину багаторазово переосаждают. Отримують сульфат гентаміцину 80 - 85% ступеня чистоти з виходом 25% від вмісту антибіотика в нативному розчині (Пат. США, N 3091572). За відомим рішенням (а.с. CCCР N 528775) технічний елюат очищають від домішок обробкою водневої формою сільносшітого сульфокатіоніта, нейтралізацією анионитом, обробкою вугіллям і висушуванням елюата. Гентаміцин сульфат, отриманий за цим способом, містить 15 - 20% мінорних домішок. Існують способи очищення шляхом кристалізації з етанолу (а.с. СРСР N 694034). Цей метод пов'язаний з використанням органічних розчинників і не гарантує отримання гентаміцину необхідного компонентного складу. Найбільш ефективними способами очищення є хроматографічні методи. За патентом ФРН N 2130113 гентаміцин очищають пропусканням водного розчину сирцю гентаміцину через колонку з силікагелем або сульфат гентаміцину 90% ступеня чистоти з виходом близько 20%. Описано спосіб хроматографічного очищення з використанням силікагелю і суміші розчинників хлороформ-метанол-аміак (Пат. США N 3.651.042). За цим способом отримують з сирцю комплексу гентаміцину окремі основні компоненти C1a; C2; C1 90 - 95% ступеня чистоти. Недоліками способу є тривалість процесу, велика витрата органічних розчинників. Найбільш близьким за технічним рішенням і досягається позитивного ефекту є спосіб виділення гентаміцину за патентом ВНР N 167121 та може служити прототипом запропонованого винаходу. За цим способом гентаміцин комплекс сорбують з відфільтрованої ферментаційної рідини натрієвої формою карбоксильного катионита, поміщеного в традиційну іонообмінну колону протягом не менше 24 - 30 годин, десорбируют 4 н. розчином сірчаної кислоти. Елюат нейтралізують триетиламіном і обробляють вугіллям. Фільтрат осаджують десятикратним об'ємом метанолу. Сирець гентаміцину сульфату очищають шляхом його розчинення в дистильованої воді, повторної сорбції на спеціальному мелкозернистом катионите в аммониевой формі (амберліт CG-50 тип II), десорбції розчином аміаку поступово підвищується в межах 0,05 - 1,0 н. концентрації. Гентаміцин комплекс виділяють з об'єднаних елюатів шляхом висушування елюата насухо. Обробки висушеного порошку підстави гентаміцину сумішшю бензолу і етанолу (1: 1) і сушіння в вакуумі над п'ятиокисом фосфору при 60oC. Отриманий комплекс підстави гентаміцину розчиняють в дистильованої воді, розчин підкислюють до pH 4,5 сірчаною кислотою (5 н.). Розчин обробляють вугіллям. Фільтрат змішують з десятикратним об'ємом метанолу. Облоги суміш витримують 24 години при 0oC, потім фільтрують і сушать у вакуумі над п'ятиокисом фосфору. Отримують гентаміцин сульфат в виходом 35 - 40% від вмісту антибіотика в ферментаційної рідини. Основними недоліком прототипу є многостадийность і тривалість процесу - 24 стадії, 250 - 300 годин (див. Схему), низький вихід цільового продукту (35 - 40%). Тривалість процесу десорбції 4 н сірчаної кислотою після першої сорбції (12 - 15 годин) призводить до підвищеного забруднення елюата з цільовим речовиною фарбуючими домішками і продуктами часткового розкладання гентаміцину, що призводить до необхідності додаткового очищення перед другою сорбцией. Недоліком є ​​також наступне. Для виділення цільового продукту використовують велику кількість органічних розчинників, в тому числі особливо отруйного - метанолу. Для сорбції гентаміцину використовують тільки відфільтровану ферментаційне рідина. Процес її фільтрації трудомісткий, вимагає спеціального обладнання, наповнювачів, є екологічно шкідливим. Сорбцію проводять в традиційних іонообмінних колонах в динамічних умовах в системі послідовних колон. В процесі сорбції створюється високий гідродинамічний опір шару сорбенту руху ферментаційної рідини за рахунок поступового ущільнення сорбенту. Процес сповільнюється до 24 - 36 годин, утворюються місцеві канали з переважним протіканням розчину, т. Е. Створюються несприятливі умови для масообміну між сорбентів і розчином. При збільшенні швидкості потоку ферментаційної рідини через шар сорбенту відбувається значний винесення сорбенту, а, отже, втрата сорбованої цільового продукту. Метою пропонованого винаходу є спрощення способу виділення гентаміцину і підвищення виходу цільового продукту. Зазначена мета досягається шляхом контактування сорбенту з ферментаційної рідиною протягом не менше 4 годин на сорбційно-промивному апараті, пропускання через катионит спочатку 0,03 - 0,045 н. (Переважно 0,04 н.) Розчину аміаку зі швидкістю 6 - 10 мл / г-годину, а потім 2 н. розчину аміаку за 4-5 годин. Заявляється спосіб полягає в наступному: в ферментаційне рідину додають щавлеву кислоту до pH 1,8 - 2,2, ПАР-цетазол - для зниження в'язкості і усунення злипання частинок сорбенту (в разі використання відфільтрованої ферментаційної рідини цетазол не додають), нейтралізують розчином лугу до pH 6,2 - 6,8. В колону з розширювачем у верхній зоні, забезпечену у вузькій циліндричній частині насадками КРІМЗ, а також пульскамерой і аерліфт (див. Креслення), поміщають катионит КБ-2 (або інший карбоксильний катионит) в Na або NH4-формі. Ферментаційне рідина контактують з катионитом пропусканням рідини від низу до верху в періодичному або безперервному режимі не менше 4 годин. Катионитом сорбируется 95 - 98% гентаміцину, що міститься в фермертаціонной рідини. Після закінчення сорбції катіонів промивають пом'якшеної водою, а потім протягом 16 - 18 годин через катионит пропускають зверху вниз 0,03 - 0,045 н. водний розчин аміаку зі швидкістю 6 - 10 мл / г-годину. Тривалість промивки - 16 - 18 годин. В процесі промивки катионита слабким розчином аміаку з катіоніту витісняють мінорні компоненти і фарбують домішки. Закінчення промивання встановлюють за змістом мінорних компонентів і фарбувальних домішок в окремих фракціях, що відбираються в процесі промивки. Для визначення компонентів в комплексі гентаміцину (основних і мінорних) у фракціях під час промивання 0,03 - 0,045 н. аміаком, а також при десорбції антибіотика 2 н розчином аміаку використовують метод ТШХ. Антибіотик десорбируют з катіоніту протягом 4-5 годин 2 н розчином аміаку. Отриманий елюат випарюють, концентрат обробляють вугіллям (для видалення залишків фарбувальних домішок), підкисляють сірчаною кислотою до pH 4 - 4,5 і видаляють з нього воду висушуванням насухо. Отримують порошок гентаміцину сульфату за якістю, що задовольняє вимоги НТД (ФС N 421267-82). Зміст мінорних компонентів в препараті не перевищує 3 - 5%. Вихід гентаміцину становить 52 - 60% від вмісту його в ферментаційної рідини. Істотна відмінність описуваного способу полягає в тому, що сорбцію антибіотика проводять як з нефільтрованої ферментаційної рідини, так і після її фільтрації (переважно з нефільтрованої). Ферментаційне рідина контактують з сорбентом в сорбційно-промивному апараті протягом не менше 4 годин, після чого сорбент промивають спочатку 0,03 - 0,045 н. розчином аміаку, який пропускають зі швидкістю 6 - 10 мл / г-годину, а потім 2 н. розчином аміаку 4-5 годин. Описуваний спосіб дозволяє спростити процес: замість 24 стадій по прототипу в заявляється способу весь процес складається з 9 стадій (див. Додаток), що дозволяє скоротити в 4-5 разів загальний час процесу (за рахунок скорочення часу сорбції, усунення другий сорбції з елюата, скорочення часу промивки). За прототипу весь процес виділення і отримання порошку сульфату гентаміцину протікає протягом 250 - 300 годин. За пропонованим способом - 50 годин. Скорочення часу процесу виділення препарату в кілька разів збільшує відповідно в стільки ж разів продуктивність процесу. Крім того, використання сорбційно-промивного апарат для сорбції гентаміцину дозволяє виключити стадію попереднього відділення біомаси та проводити сорбцію безпосередньо з нефільтрованої ферментаційної рідини, що значно скорочує втрати продукту. Описуваний спосіб дозволяє підвищити вихід цільового речовини на 17 - 20% в порівнянні з прототипом (по прототипу 35 - 40% від ферментаційної рідини, а за пропонованим способом - 52 - 60%). Спосіб ілюструється такими прикладами. Приклад 1 У 40 л ферментаційної рідини гентаміцину з активністю 800 мкг / мл вносять 220 мл 20% -го розчину цетазола, суміш перемішують 10 хв, потім в неї вносять 3,65 л насиченого розчину щавлевої кислоти (pH 1,8 - 2,2 ). Масу перемішують 20 - 30 хв, потім її нейтралізують 30% -ним розчином їдкого натру до pH 6,2 - 6,8. Загальний обсяг суміші - 44 л. Сорбцію з нефільтрованої ферментаційної рідини проводять в сорбційно-промивному апараті (див. Креслення), що складається з вузької циліндричної насадок частини апарату і розширювача. Апарат забезпечений пульскамерой і аерліфт. Обсяг циліндричної частини колони - 10 л; діаметр - 10 см. Обсяг розширювача - 35 л; діаметр - 30 см; загальний обсяг апарату - 50 л. В апарат завантажують 1 л карбоксильного катионита КБ-2 в NH4-формі. При включеній пульскамере (інтенсивність пульсації - 600 мм / хв) в апарат подається весь обсяг ферментаційної рідини. Після цього включають аерліфт (замкнутий на колону) і проводять сорбцію в режимі рециркуляції. Час сорбції - 4 години. При цьому катионитом сорбируется 98% гентаміцину, що міститься в фрментаціонной рідини. Після сорбції катіонів відмивають від залишків міцелію пом'якшеної водою, для чого при працюючому ПУЛЬСАТОР (інтенсивність пульсації не менше 400 мм / хв подають воду подачею від низу до верху. Потім через катионит пропускають зверху вниз 20,2 л 0,04 н. Розчин аміаку зі швидкістю 8 мл / г-год. ​​Тривалість промивки - 16 годин. При промиванні катионита слабким розчином аміак відбирають фракції елюатів по 2 л кожну (з розрахунку дворазового обсягу сорбенту), в яких визначають компонентний склад (методом ТШХ - в системі хлорформ-метанол - 25% -ний розчин аміаку в з відношенні 2: 1: 1, прояв в парах йоду). Контролем вимивання є відсутність мінорних домішок в останніх фракціях промивок. Після вимивання мінорних і фарбувальних домішок з катіоніту через нього пропускають протягом 4-5 годин 2,0 н. розчин аміаку. Збирають елюат фракцій, які мають активність не менше 1000 мкг / мл і містять тільки основні компоненти гентаміцину, які об'єднують. елюат випарюють у вакуумі до концентрації антибіотика, що дорівнює 180000 мкг / мл (в 5-6 разів від початкового об'єму елюата). Отримують 117,7 мл концентрату, який підкислюють сірчаною кислотою до pH 4,5, змішують з 8 г осветляющего вугілля, суспензію фільтрують, кут промивають 50 мл дистильованої води. Промивання приєднують до основного освітлений розчин. Практично безбарвний розчин гентаміцину висушують на роторному випарнику. Отримують 31,8 г білого порошку сульфату гентаміцину з активністю 600 мкг / мг і вмістом вологи 5%. Активність порошку в перерахунку на суху речовину - 631 мкг / мг (98,5% ступеня чистоти). Зміст основних компонентів в субстанції (порошку) комплексу гентаміцину: C1a - 26%; C2 - 38,5%; C1 - 34%; зміст мінорних домішок - 1,5% (компонентний склад визначений методами ТШХ і ВЕРХ). Інші показники якості субстанції сульфату гентаміцину задовольняють вимогам ФС N 42-1267-82. Вихід гентаміцину сульфату становить 59,6% від змісту антибіотика в ферментаційної рідини. Приклад 2 В 40 л ферментаційної рідини гентаміцину з активністю 800 мкг / мл вносять при перемішуванні 535 г щавлевої кислоти до pH 1,8, потім в ферментаційне рідина вносять 117,6 г триполіфосфату натрію. Після витримки без перемішування ферментаційне рідину фільтрують на фільтр-пресі, на який перед фільтрацією наносять у вигляді суспензії фільтруючий наповнювач - перліт. Тривалість фільтрації - 10 годин. Потім відфільтрований міцелій промивають на фільтр-пресі пом'якшеної водою і промивну воду приєднують до відфільтрованої ферментаційної рідини. Потім фільтрат нейтралізують 30% -ним розчином їдкого натру до pH 6,5 (6,2 - 6,8). Отримують 36,7 л нативного розчину з активністю 610 мкг / мл. Втрати на стадії фільтрації складають 30%. Сорбцію гентаміцину проводять в сорбційно-промивному апараті, в який завантажують 560 мл катионита КБ-2 в NH4-формі. Сорбція, відмивання пом'якшеної водою від залишків нативного розчину, промивка слабким розчином аміаку, десорбція, упарки, освітлення і виділення порошку гентаміцину проводяться в умовах, наведених в прикладі 1. Отримують 27,8 г сульфату гентаміцину з активністю 595 мкг / мг і вміст вологи 6 , 3%. Активність порошку в перерахунку на суху речовину 635 мкг / мг (99% ступеня чистоти). Зміст основних компонентів в субстанції (порошку) комплексу гентаміцину: C1a - 25,0%; C2 - 39,5%; C1 - 34,5%: вміст мінорних домішок - 1%. Інші показники якості субстанції сульфату гентаміцину задовольняють вимогам ФС N 42-1267-82. Вихід гентаміцину сульфату становить 51,7% від змісту гентаміцину в ферментаційної рідини. Приклад 3 Що відрізняється від прикладу 1 тим, що сорбцію ведуть в динамічному режимі, подаючи безперервно знизу колони попередньо підготовлену для вилучення ферментаційне рідина з виходом відпрацьованої ферментаційної рідини через верхній вихід в розширнику на слив. З цією метою 40 л ферментаційної рідини гентаміцину з активністю 800 мкг / мл обробляють як описано в прикладі 1 і розводять знесоленої водою до загального об'єму 80 л. У сорбційно-промивної апарат, описаний в прикладі 1, завантажують 500 мл набряклого карбоксильного катионита КБ-2 в NH4-формі. Включають пульсацію (інтенсивність пульсації 600 мм / хв) і протягом 7 годин пропускають 80 л обробленої і розведеної як зазначено вище вдвічі ферментаційної рідини гентаміцину. При цьому катионитом сорбируется 98% антибіотика при насиченні 62,7 мг / мл. Відмивання залишків міцелію пом'якшеної водою, промивка катіоніту від супутніх домішок, десорбція і виділення субстанції гентаміцину сульфату проводиться як в прикладі 1. Отримують 32,0 г порошку сульфату гентаміцину з активністю 602 мкг / мг і задовольняє вимогам ФС N 42-1267-82. Зміст мінорних домішок - 1,6%. Зміст основних компонентів C1a - 26,5%; C2 - 38,0%; C1 - 33,9%. Вихід гентаміцину сульфату становить 60,2% від змісту антибіотика в ферментаційної рідини.

формула винаходу

Спосіб виділення антибіотика гентаміцину, що включає обробку ферментаційної рідини, сорбцію карбоксильним катионитом, вимивання домішок з катіоніту, десорбції і виділення цільового продукту, що відрізняється тим, що сорбент контактують з ферментаційної рідиною протягом не менше 4-х годин в сорбційно-промивному апараті, після чого через катионит пропускають спочатку 0,03 - 0,045 н розчин аміаку зі швидкістю 6 - 10 мл / г-годину, потім 2 н розчин аміаку за 4-5 год.

МАЛЮНКИ

, малюнок 2