Аналізи на туберкульоз

1. Бактеріоскопічний метод
2. метод флотації
3. люмінесцентна мікроскопія
4. Фазовоконтрастна мікроскопія
5. Дослідження змиву з бронхів
6. Дослідження сечі, калу, цереброспинальной і плевральної рідини на МБТ
7. Попередня обробка біологічного матеріалу
8. біологічний метод
9. Прискорені методи пошуку мікобактерій
10. Молекулярно-генетичні методи

Мокротиння хворого - це суміш секрету залоз слизової оболонки трахеї і бронхів, серозного випоту з патологічно змінених судин, іноді частинок казеозних мас, некротической грануляційної і легеневої тканини, а також домішки солей. Мокротиння виділяється при багатьох захворюваннях легенів і бронхів.

У туберкульозних установах хворі збирають мокроту в індивідуальні контейнери, на чверть ємності заповнені розчином хлораміну, де воно частково дезінфікується. Контейнери градуйовані, і це дає можливість визначати добове кількість мокротиння.

Макроскопічно у хворих на туберкульоз легень мокротиння має слизовий або слизисто-гнійний характер, без запаху, гомогенна, не утворює шарів. Кількість мокротиння може бути різною. На початку захворювання на туберкульоз легенів мокротиння не виділяється, потім воно може виділятися вранці окремими плювками, пізніше його кількість може досягати 100-200 мл.

Після макроскопічного проводять бактеріоскопічне, бактеріологічне та біологічне дослідження мокротиння.

Бактеріоскопічний метод

Бактеріоскопічний метод охоплює пряму бактеріоскопію мазків з патологічного матеріалу, забарвлених за Цілем-Нільсеном, бактеріоскопію методом флотації, люмінесцентну мікроскопію, фазовоконтрастного мікроскопію.

Бактеріоскопічне дослідження мокротиння починається з приготування мазка. Для цього мокротиння змішують з розчином натрію гідроксиду і центрифугують для отримання осаду. Осад скляними паличками переносять на предметне скло. Другим предметним склом його рівномірно розміщують: накривають покривним склом. Препарат вивчають під мікроскопом. У ньому можна побачить лейкоцити, еластичні волокна, а при спеціальній забарвленням - атипові клітини і різні бактерії.

Мікобактерії фарбуються за Грамом позитивно. Для виявлення МБТ готують мазок мокротиння висушують його, фіксують над полум'ям спиртівки, після чого фарбують за Цілем-Нільсеном. Фарбування проводиться спочатку карболовим розчином фуксину . Мікобактерії туберкульозу погано сприймають забарвлення, тому розчин фуксину наносять на препарат у великій кількості, підігрівають над полум'ям спиртівки до появи пара. Потім фарбу зливають, препарат промивають у воді і знебарвлюють в 5% розчині сірчаної кислоти або в суміші етилового спирту з розчином соляної кислоти. При цьому всі бактерії і морфологічні елементи мокротиння, крім мікобактерій туберкульозу, безбарвні. Мазок промивають проточною водою, а потім наносять метиленовий синій на 1-2 хв. Після цього розчин фарби зливають, мазок промивають і висушують. Препарат вивчають через иммерсионной систему мікроскопа, для чого на препарат наносять краплю иммерсионного масла, щоб створити однакову середу між лінзою об'єктива і препаратом. Мікобактерії туберкульозу під мікроскопом видно пофарбованими в червоний колір.

Метод забарвлення за Цілем-Нільсеном дозволяє виявити мікобактерії туберкульозу в тих випадках, коли в 1см3 мокротиння міститься близько 5000 - 10000 МБТ за умови, якщо переглянуто 300 полів зору. При невеликій кількості МБТ в мокроті бактериоскопический метод неефективний.

Дослідження мокротиння слід проводити протягом трьох днів поспіль, а при негативному результаті - застосувати метод флотації .

метод флотації

Він заснований на тому, що при струшуванні двох рідин з різною питомою вагою легше рідина спливає на поверхню одночасно з мікобактеріями туберкульозу, що знаходяться в суспензії. Суть методики полягає в тому, що готують водну суспензію з вуглеводнями (ксилол, бензол) і МБТ. На поверхню води витече слівкообразние піна з МБТ, яку відсмоктують піпеткою і наносять на предметне скло. Шар піни на предметному склі висушують і наносять новий шар піни з колби. Так нашаровуються піну 5-6 разів, після чого мазок фіксують і забарвлюють за Цілем-Нільсеном.

люмінесцентна мікроскопія

Ефективним методом виявлення мікобактерій туберкульозу є люмінесцентна мікроскопія. Суть методу полягає в здатності мікобактерій туберкульозу, пофарбовані спеціальними барвниками (аурамін, родамін), світитися при опроміненні ультрафіолетовими променями. Перевагою методу люмінесцентної мікроскопії є можливість проведення досліджень при менших збільшеннях мікроскопа, забезпечує перегляд в короткий термін більшої кількості полів зору, ніж при звичайній мікроскопії. Можливість виявлення мікобактерій туберкульозу збільшується на 10-15% в порівнянні зі звичайною бактеріоскопії і на 8% - в порівнянні з методом флотації.

Використовують люмінесцентний мікроскоп під малим збільшенням. На темному тлі видно золотисто-жовті мікобактерії туберкульозу.

Фазовоконтрастна мікроскопія

Це єдиний мікроскопічний метод дослідження, що дозволяє спостерігати мікобактерії і їх біологічно змінені форми в живому стані. Для проведення такого дослідження застосовують спеціальне фазовоконтрастной пристрій.

При цитологічному дослідженні мокротиння у хворих на туберкульоз легень виявляється незначна кількість нейтрофілів в стадії значною дегенерації на тлі казеозного детриту, скупчення мононуклеарів, гігантських клітин Пирогова-Лангханса, іноді еозинофіли.

У випадках, коли мокротиння немає або вона виділяється в дуже малій кількості, хворому призначають відхаркувальну мікстуру або дратівливі інгаляції. Крім того, у випадках, коли немає мокротиння, досліджують змив з бронхів.

Дослідження змиву з бронхів

Воно проводиться лікарем. Для цього хворому натщесерце змащують корінь язика, задню стінку глотки і надгортанник 1% розчином дикаїну. Потім гортанним шприцом вливають в трахею 5-10 мл ізотонічного розчину натрію хлориду . У хворого відразу виникає сильний кашель і введений ізотонічний розчин натрію хлориду викашлівается на чашку Петрі. Також змив з бронхів (БАС - бронхоальвеолярний змив) отримують за допомогою БАЛ - бронхо-альвеолярного лаважу, який проводять при бронхоскопії. БАЗ досліджують методом флотації або методом посіву. Дослідження змиву з бронхів дозволяє додатково виявляти МБТ в 5-10% випадків.

Дослідження сечі, калу, цереброспинальной і плевральної рідини на МБТ

У клінічній практиці МБТ нерідко доводиться проявляти в сечі, калі, цереброспинальной і плевральної рідини. Дослідження сечі на МБТ проводять в тих випадках, коли в ході дослідження осаду в кожному полі зору виявляється не менше 15 лейкоцитів.

Для виявлення МБТ сечу багаторазово центрифугируют, нашаровуючись кожен раз нові порції з осаду сечі на предметне скло. Мазок забарвлюють за методом Діля-Нільсена. Виявлення мікобактерій туберкульозу в сечі свідчить про наявність туберкульозу нирок.

Для дослідження сечі за методом флотації дають їй постояти, потім 20-30 мл осаду обробляють, як зазвичай, без підігріву на водяній бані. Відсутність МБТ в гнійної сечі і це не виключає наявності туберкульозу нирок . У таких випадках потрібно або робити її посів на поживні середовища, або застосовувати біологічний метод дослідження.

Дослідження калу на МБТ слід проводити у випадках підозри на туберкульоз кишок. При цьому треба пам'ятати, що у хворих, що виділяють МБТ і частково заковтують мокроту, МБТ можна виявити при дослідженні калу і за неуражених кишок, оскільки мікобактерії туберкульозу стійкі і не завжди гинуть під впливом травних соків. У калі хворих на туберкульоз кишок часто виявляється слиз, кров і домішки гною.

Виявлення МБТ в цереброспинальной рідини нерідко має вирішальне значення в діагностиці туберкульозного менінгіту. Однак бактеріоскопічному методом виявити МБТ вдається тільки в 10-20% хворих туберкульозний менінгіт. Дослідження проводиться за такою методикою. Пробірку з цереброспинальной рідиною ставлять на 8-10 годин в прохолодному місці. Якщо в ній утворюється ніжна фібрину плівка (вона складається з клітин і МБТ), її наносять на предметне скло і готують препарат за методом Циля-Нільсена. У випадках, коли плівка не утворюється, препарат готують з осаду після центрифугування.

Для виявлення МБТ в плевральному ексудаті, пунктатах і виділення з свищів готують препарат так само, як і при дослідженні мокротиння.

Бактеріологічне дослідження складається з посіву матеріалу на живильні середовища і диференціації культури МБТ від кислотостійких сапрофітів. Цим методом можна виявити мікобактерії туберкульозу, коли в 1 мл матеріалу знаходиться 20-100 мікробних клітин. Пробірки із середовищем поміщають в термостат при температурі 37 ° С. Перші колонії мікобактерій можуть з'явитися на 18-30-й день, а іноді - через 2-3 місяці. Бактеріологічне дослідження проводять одночасно з бактеріоскопічному тричі.

Посів досліджуваного матеріалу проводиться на спеціальні середовища після попередньої обробки. Найчастіше використовують такі середовища: Левенштейна-Йенсена, Фінна-2, Міддлбрука, Огава і ін., Які містять речовини, що затримують зростання сторонніх мікроорганізмів. Попередня обробка патологічного матеріалу полягає в знищенні супровідної бактеріальної флори. Посів матеріалу з бронхів, а також посів сечі роблять з центрифугата або осаду. При цьому сечу, якщо вона не забруднена, можна не обробляти.

Попередня обробка біологічного матеріалу

Для підготовки до посіву мокротиння, плеврального ексудату, цереброспинальной рідини існує кілька методів попередньої обробки.

Метод Мазура полягає в обробці патологічного матеріалу 3-4 мл 2% розчином сірчаної кислоти в стерильній пробірці. Пробірку струшують протягом 3 хв., Після чого матеріал стерильною платинової петлею наносять на яєчні середовища.

Метод Петрова: мокротиння обробляється 4% розчином гідроксиду натрію протягом 15 хв., А потім центрифугируется.

біологічний метод

Це прищеплення патологічного матеріалу тваринам. Гвінейських свинкам або білим мишам в паховій ділянку або в черевну порожнину вводять досліджуваний матеріал в дозі 2-3 мл. Для цього його спочатку обробляють 3 8% розчином соляної кислоти, добре відмивають (інакше на місці введення може виникнути некроз тканин, можлива навіть смерть тварини від впливу кислоти).

Незабруднену сечу і СМЖ можна прищеплювати без попередньої обробки. При наявності в патологічному матеріалі вірулентних штамів МБТ тваринного захворюють на туберкульоз і гинуть через 1-2 місяці після зараження. Якщо МБТ мас ослаблену вірулентність, тварина гине пізніше або може зовсім не загинути. У таких випадках тварина забивають, і діагноз встановлюють після розтину, макро- і мікроскопічного виявлення туберкульозних горбків. Діагноз можна поставити на підставі прижиттєвого дослідження збільшеного регіонар лімфатичного вузла або інфільтрату, що виник на місці інокуляції патологічного матеріалу.

В останні роки для диференціації мікобактерій використовують метод газорідинної хроматографії, заснований на високій здатності різних сполук (амінокислот, нуклеїнових кислот, жирів, вуглеводів і т. Д.). При цьому не виключається етап культивування збудника на живильних середовищах, що можна віднести до недоліків методу.

Прискорені методи пошуку мікобактерій

До прискореним методам виявлення мікобактерій належать виявлення МБТ за допомогою індикаторного пробірки ВВL МОІТ. Зростання мікобактерій туберкульозу відбувається протягом 4-10 діб. Пробірки ВВL МОІТ містять бульйон і флуоресцентне з'єднання, реагує на кисень, розчинений в бульйоні. Вихідна концентрація кисню не дає яскравого світіння. При поглинанні кисню культурою МБТ спостерігається яскрава флуоресценція на дні пробірки. Такий результат вважають позитивним. Якщо флуоресценції немає або вона незначна - результат негативний. Показання пробірок враховують щодня, починаючи з другого дня інкубації.

Останнім часом для діагностики туберкульозу використовують імуноферментальні та молекулярно-генетичні методи.

Молекулярно-генетичні методи

З'явилися методи ідентифікації МБТ за допомогою моноклональних антитіл, отриманих способом гібридомної технології. Зараз існує більше 100 моноклональних антитіл до епітопів основних антигенів МБТ. Застосування цих антитіл в иммуноферментном аналізі дає можливість дуже швидко диференціювати вид збудника, але поки метол використовується в наукових розробках для ідентифікації збудника туберкульозу, який найчастіше зустрічається.

Серед молекулярно-генетичних методів діагностики туберкульозу найчастіше застосовується метод ДНК-зондів і полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). В основі цих методів лежить принцип комплементарності нуклеотидних підстав в побудові двуспиральной молекули ДНК. При проведенні ДНК-зондування в разі наявності в пробі досліджуваного специфічної ділянки ДНК мікобактерій утворюється гібрид (Дволанцюговий фрагмент) ДНК досліджуваного і ДНК-зонда.

В основі приципах ПЛР лежить багаторазове збільшення фрагмента ДНК. Для ампліфікації (багаторазового подвоєння гена бактерій) потрібна наявність двох праймерів (запалів) - невеликого одноланцюжкові фрагмента ДНК, що з'єднується з комплементарної ділянкою однієї з ланцюгів матричної ДНК. Надалі відбувається добудова цього ланцюга ДНК-полімеразою. Збільшення кількості (в 106 разів) фрагмента амплифицируемого виявляється електрофорезом в агарових гелі. Облік результатів реакцій здійснюється під пластинами трансілюмінатора в ультрафіолетовому світлі,

ДНК-зондування дозволяє проводити визначення мікобактерій в діагностичному матеріалі протягом 2-4 діб, а ПЛР - за 4-6 год. З максимально високою чутливістю методів - 10-100-1000 клітин в пробі досліджуваного.