Модульні хіміо ферментативний стратегія для синтезу широкий спектр N - гліканов представлена на малюнку 1. Стратегія є ґрунтується на тому, що різноманітність можуть бути створені на початку хіміо ферментативний синтез трьох важливих модулів, слідують α-конкретних mannosylation в 3 O або 6 O положення манози залишки загального Основні трісахаріди N - гліканов. З огляду на структурного розмаїття бі-, три- і Тетра antennary складний тип N - glycan структур ми вважали, що набір oligosaccharyl донорів і акцептор трісахаріди ядро з попередньо встановленою алкіл handlecould використовуватися в якості відправної матеріали для створення бажаного структурного розмаїття (рис. 1). Застосовність glycosyl фторид донорів в створенні складних glycan бібліотека була доведена ранее21.
Щоб продемонструвати ефективність нашої стратегії, Бі antennary ізомерні структури (10, рис. 3) був обраний для синтезу. D1 руку антен 4 і D2 руку антен 5 glycan 10 були проведені на великих масштабах хіміо ферментативний методами. Зокрема дисахариди акцептора 1 був ферментативно galactosylated за допомогою β-1, 4-galactosyltransferase і уридину 5'-diphosphogalactose (UDP-Gal) для формування трісахаріди 2. Далі проміжні 2 був fucosylated в GlcNAc 3 - O позиції в присутності α-1, 3-fucosyltransferase з Helicobacter pylori (Hpα1, 3 фути), щоб дозволити собі бажаний Тетрасахаріди 3. Для хімічне лігування ядро будівельні блоки 2 і 3 були перші peracetylated, і зменшення кінця p - метокси фенолу група була видалена. Нарешті, фторид був встановлений в присутності ДАСТЬ отримати бажаний модулів 4 і 5, відповідно (Малюнок 2).
Маючи в руках бажаного модулі, Далі приступаємо до O гликозилирования стереоселективного 3 - 4 в ядро трісахаріди 6 під каталізу срібла трифлат і hafnocene Дихлорид надавати відповідні hexasaccharide 7 (Рис. 3). Benzylidene захисту, що маскування 4, 6-ий був вилучений за допомогою каталізатора p -толуол сульфокислоти (p - TSA). Скориставшись його реактивність, основний 6-OH 8 був прореагував з фторид модуль 5 аналогічних експериментальних умовах для досягнення необхідних decasaccharide 9. Нарешті була проведена Глобальна deprotection отримати glycan 10, який характеризувався далі за допомогою ЯМР і мас-спектроскопії (див. Додатковий файл даних).
Глікани, що містить Пента Амін хвіст кінці скорочення були змінені з фосфонова кислота лінкери і додає поверхні ACG через phosphonate хімії (рис. 4). У минулому, ВІЛ-1 bNAb PG9 був показаний для його специфіка glycan використанням гомо - і гетеро гліканов масиви для демонстрації в перший раз, що PG9 взаємодіяв з рядом heteroglycans в циклі V1 / V2 поверхні gp120 ВІЛ-1 (рис. 5).
Малюнок 1: Загальна модульної стратегії для підготовки N - гліканов. (A) кількість N - гліканов породжених цієї стратегії, які зазвичай відбуваються на людських глікопротеїнів оцінками, перевищує 20 000. (B) три типи модулів, підготовлений цією хіміо ферментативний підхід, який може використовуватися для α-seletive glycosylations. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Малюнок 2: синтез Chemoenzymatic модулів. i, UDP-галактози, β 1, 4-Галт, 15 ч, 86%; ii, ВВП фукоза, α 1, 3-FucT, 15 ч, 84%; III, (1) Ac2O, піридин, RT, 12 h; (1) може, АКС: Толуол: H2O, (3) ДАСТЬ, CH22Cl-30 oC. можна: церію амонію нітрату; ДАСТЬ: Фторид Diethylaminosulfur.
Номенклатура продукції: 1, p -methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl- (1 → 2) -α-D-mannopyranoside; 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl- (1 → 4) -2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl- (1 → 2) -α-D-mannopyranoside; 3, p -O-β-D-galactopyranosyl- (1 → 4) - [α-L-fucopyranosyl- (1 → 3) -2-acetamido-2-deoxy-β-об'ємним-glucopyranosyl] - (1 → 2 ) -α-об'ємним-mannopyranoside - methoxyphenyl; 4, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl] - (1 → 4) - [3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl ] - (1 → 2) -3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl фторид; 5, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl] - (1 → 4) - [2,3,4-O-triacetyl-α-L-fucopyranosyl (1 → 3) - 3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl] - (1 → 2) -3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl фторид , Будь ласка, натисніть тут для перегляду більша версія цієї фігури.
Малюнок 3: Хімічна гликозилирования D1 / D2 руку модулів ядра акцептора. я, 4, AgOTf, Cp2HfCl2, толуол, 4 Å МС, 0 oC на RT, 70%; ii, p - TSA, ацетонітрилі, RT, 57%; III, 5, AgOTf, Cp2HfCl2, толуол, 4 Å МС, 0 oC на RT, 34%; iv (1) LiOH, 1,4-діоксану: H2O; 90 oC, 12 h; (2) Ac2O, піридин, 12 h; (3) NaOMe, метанолу, 12 h; (4) Pd (OH) 2, метанолу: H2O: HCOOH (5: 3: 2), H2, 36%. AgOTf: Сріблястий trifluromethanesulfonate; CP2HfCl2: біс (cyclopentadienyl) Гафній Дихлорид, MS: молекулярні сита, Номенклатура продукції: 7, 5-Azidopentyl-O - {[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl] - (1 → 4 ) - [3,6-O-diacetyl-2 Acetamido-2-Deoxy-β-D-glucopyranosyl] - (1 → 2) - [3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]} - (1 → 3) - [2-O-Acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl- (1 → 4) -O- (3,6-Di-O-benzyl-2-Deoxy -2- (2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosyl) - (1 → 4) -O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2- (2,2, 2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosid. 8, 5-Azidopentyl - O- (2-O-ацетил-3,4,6-tri-O-benzyl-α-D-mannopyranosyl- (1 → 3) -2-O-acetyl-4,6-O -benzylidine-β-D-mannopyranosyl- (1 → 4) -O- (3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl) - (1 → 4) -O -3,6- di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranoside. 9, 5-Azidopentyl-O - {[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D -galactopyranosyl] - (1 → 4) - [3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl] - (1 → 2) - [3,4,6-O-triacetyl -α-D-mannopyranosyl]} - (1 → 3) - {2,3,4,6- O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl] - (1 → 4) - [2,3,4-O- triacetyl-α-LS160fucopyranosyl- (1 → 3) -3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl] - (1 → 2) -3,4,6-O-triacetyl -α-D-mannopyranosyl} - (1 → 6) - [2-O-acetyl-β-D-mannopyranosyl- (1 → 4) -O- (3,6-Di-O-benzyl-2-Deoxy- 2- (2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosyl) - (1 → 4) -O-3,6-Di-O-benzyl-2-Deoxy-2- (2,2,2 -trichloroethoxy) carbonylamino-β-Dglucopyranoside 10, 5 Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl- (1 → 4) -2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl- (1 → 2) -α -D-mannopyranosyl] - (1 → 3), - [β-D-galactopyranosyl- (1 → 4) (α-L-fucopyranosyl- (1 → 3) -2-2-acetamido-2-deoxy-β- D-glucopyranosyl) - (1 → 2) - Α-D-mannopyranosyl] - (1 → 6) -β-D-mannopyranosyl- (1 → 4) -2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl- (1 → 4) -2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Малюнок 4: Glycan іммобілізації на масив ACG. (A) хімічна модифікація glycan з аміно хвіст в фосфонова кислота хвіст ковалентних вкладення в ACG слайд через phosphonate хімії. (B) розподіл гліканов на поверхні АКГ. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Малюнок 5: аналіз масиву Glyan. (A) структури синтетичних N - гліканов, які друкуються на масив АКГ. (B) обов'язкового аналізу PG9 для окремих гліканов I-XI надруковані на ACG масив (ліва панель) і glycan суміші человек5 змішаного з гліканов I-XI (права панель) з концентрацією 100 мкм. Молярна концентрація в мкм для PG9 дані в умовних позначеннях. Середній сигнал інтенсивності та стандартна помилка розраховані для п'яти незалежних реплицирует на масиві відображаються. Вставками показують зображення флуоресценції. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
