1 Куркіна А.В. 1 Афанасьєва П.В. 1 Куркін В.А. 1 Платонов І.А. 2 Павлова Л.В. 2
1 Державна бюджетна освітня установа вищої професійної освіти «Самарський державний медичний університет» Міністерства охорони здоров'я Російської Федерації
2 Федеральне державне автономне освітня установа вищої освіти «Самарський державний аерокосмічний університет імені академіка С.П. Королева (Національний дослідницький університет) »
У статті наводиться порівняльна характеристика підходів до стандартизації календули лікарської в різних фармакопеях світу. Проведено дослідження по обгрунтуванню і розробці методик кількісного визначення домінуючих з'єднань календули лікарської за допомогою комплексу методів - ТШХ-аналізу, спектрофотометрії та високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ). Порівняльне дослідження водно-спиртових витягів квіток календули методом ТШХ показало, що на хроматограмах домінуючим компонентом є нарціссін (3-O-рутинозид ізорамнетін), який при прояві хроматограми розчином діазобензолсульфокіслоти виявляється у вигляді домінуючого плями жовто-оранжевого кольору з Rf близько 0,45 або Rs близько 1,1 щодо рутина. Результати фітохімічних досліджень дозволяють використовувати диференціальну спектрофотометрію для кількісного визначення суми флавоноїдів в перерахунку на ДСО рутин при аналітичної довжині хвилі в 412 нм. З використанням методу ВЕРХ визначено зміст домінуючого з'єднання (нарціссіна) методом ВЕРХ в зразках водно-спиртового витягу квіток календули лікарської, яке варіює від 0,57 ± 0,02% до 0,72 ± 0,03%. Виявлення нарціссіна як домінуючого і біологічно активного флавоноїду має діагностичне значення, що є доцільним для цілей стандартизації сировини і препаратів календули лікарської. Результати чіткого хроматографічного розділення компонентів вилучення з квіток нагідок дозволяють пропонувати використання методу ВЕРХ для визначення автентичності сировини і препаратів даної рослини.
стандартизація
ВЕРХ
ТШХ
спектрофотометрія
изокверцитрин
рутин
нарціссін
флавоноїди
препарати
квітки
Calendula officinalis L.
нігтики
календула лікарська
1. Державна Фармакопея Республіки Казахстан: Т. 2. - Изд. 1-е - Алмати: Видавничий дім «Жибек Жоли», 2009. - С. 704-705.
2. Державна фармакопея СРСР: Вип. 2. Загальні методи аналізу. Лікарська рослинна сировина / МОЗ СРСР. Вид. 11-е, доп. - М .: Медицина, 1990. - C. 237-238.
3. Державна фармакопея України. Харків, 2011. - 1-е вид. Доп. 4. - 540 с.
4. Кащенко Н.І. Фітохімічне дослідження і вдосконалення методів стандартизації квіток і трави календули лікарської (Calendula officinalis L.): дис. ... канд. фармац. наук.- Улан-Уде, 2014. - 223 с.
5. Куркін В.А. Фармакогнозія. Підручник для студентів фармацевтичних вузів (факультетів). Вид. 2-е, перераб. і доп. - Самара: ТОВ «Офорт»; ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава», 2007. - 1239 с.
6. Куркін В.А., Шарова О.В. Флавоноїди квіток Calendula officinalis // Хімія природних сполук. - 2007. - № 2. - С. 179-180.
7. Куркін В.А., Шарова О.В. Розробка методик стандартизації квіток нагідок // Фармація. - 2007. - № 8. - С. 11-13.
8. Сампо А.М., Хочава М.Р. Календула лікарська. - Краснодар: Радянська Кубань, 2010. - 144 с.
9. European Pharmacopea, 6.0, 2008, «Herbal drugs».
10. German Homeopathic Pharmacopoeia (GHP). - Stuttgart: Deuscher apotheker Verlag, 1993. - P. 155-156.
Проблема створення сучасних вітчизняних імпортозамінних лікарських засобів є одним із актуальних завдань сучасної фармації. Одним з перспективних в цьому відношенні лікарських рослин є календула лікарська (нігтики) (Calendula officinalis L.). Квітки нагідок застосовуються в якості офіцинального лікарської рослинної сировини (ЛРС) в Російській Федерації та в багатьох країнах світу. Препарати календули широко використовуються у вітчизняній та в європейській медицині як протизапальних лікарських засобів, що мають регенерує, жовчогінною, відхаркувальної активністю [5, 8].
Однак, незважаючи на пильну увагу вчених до проблем стандартизації сировини і фітопрепаратів календули, до сих пір спостерігається очевидна суперечливість в підходах до фармакогностичного дослідженню рослини [1-4, 8-10]. На тлі популярності і затребуваності лікарських засобів на основі квіток нагідок за доцільне узагальнити наявні світовий досвід і оцінити з точки зору відповідності методик нормативної документації (НД) сучасним вимогам до фармацевтичного аналізу, а також обговорити результати власних досліджень по обгрунтуванню нових підходів до стандартизації сировини і препаратів даної рослини.
При розгляді було виявлено, що фармакопейна стаття 5 «Квітки нагідок» Державної фармакопеї СРСР XI видання припускає аналіз ЛРС тільки за змістом екстрактивних речовин, при цьому відсутні розділи «Якісні реакції» і «Кількісне визначення» [2].
Відносно лікарських засобів на основі календули (настоянка, екстракт) також не застосовуються адекватні методики аналізу, оскільки пропоновані показники не дають об'єктивної оцінки якості фітопрепаратів «Календули настойка», «Календули екстракт рідкий». Так, якщо з реакцією автентичності з концентрованої сірчаної кислотою на сапоніни можна погодитися, оскільки вона спрямована на визначення третьої групи діючих речовин - сапонінів, що вносять вклад в фармакологічну активність, то використання реакції на дубильні речовини з хлоридом окисного заліза не представляється специфічним для даного виду АРС . Якість даних препаратів оцінюється за змістом суми окислених речовин [5], що не відповідає сучасним уявленням про хімічну природу біологічно активних сполук квіток календули лікарської.
При розгляді нормативної документації інших країн були виявлені наступні підходи до стандартизації календули лікарської.
Вимоги до сировини в Європейській і Британської фармакопеях повністю збігаються [9]. Ідентифікацію повітряно-сухої сировини проводять за зовнішніми ознаками сировини, а також методом мікроскопії з використанням розчину хлоралгідрату. Для якісного аналізу використовується тонкослойная хроматографія (ТШХ) при 365 нм. Розчином порівняння є суміш кавової кислоти, хлорогенова кислоти і рутина в метанолі. Система розчинників: мурашина кислота безводна: вода: етилацетат 10:10:80. На наш погляд, стандарти, використовувані в методиці ТШХ-аналізу, не забезпечують специфічність АРС. Відповідно до вищезгаданих зарубіжними Фармакопеями кількісне визначення проводять на спектрофотометрі при довжині хвилі 425 нм. При цьому для кількісної характеристики використовується вміст флавоноїдів в перерахунку на гіперозид (не менше 0,4%). Розрахунок вмісту суми флавоноїдів проводиться на речовина гиперозид, що не міститься в квітках календули лікарської. Розділ «Числові показники» представлено такими характеристиками, як: сторонні домішки (квітколоже з обгортками - не більше 5%; інші домішки - не більше 2%), втрата в масі при висушуванні (не більше 12%) і зола загальна (не більше 10 %) [9].
Стандартизація квіток календули в державній фармакопеї Республіки Казахстан сформульована по аналогії з підходами Європейської фармакопеї. У даній НД також проводять випробування на мікробіологічну чистоту, важкі метали і радіонукліди [1].
У Державній фармакопеї України щодо настоянки календули пропонується проводити ідентифікацію методом ТШХ за такими діючих речовин, як флавоноїди і сапоніни (календулозіди - похідні олеанолової кислоти) [3].
Крім того, календула лікарська є популярним рослиною в гомеопатії. Так, рослина входить до Німецької гомеопатичні фармакопеї [10]. При цьому в документації в якості сировини вказана вся надземна частина рослини в період цвітіння, а не тільки квітки, як в фармакопеях інших держав. Фармакопейна стаття календули лікарської в Німецькій гомеопатичній фармакопеї представлена докладним описом зовнішніх ознак всієї надземної квітучої частини даної рослини. Крім того, в цьому документі також наводиться характеристика матричної настойки. Аналіз даної лікарської форми проводиться за допомогою методу ТШХ (детекция при 254 нм). В якості контрольного розчину використовують розчин галової кислоти в метанолі, що не забезпечує специфічність [10].
В результаті раніше проведених фітохімічних досліджень було достовірно встановлено, що домінуючим і діагностичним речовиною квіток календули є флавоноїди нарціссін (3-рутинозид-ізорамнетін) [6, 7]. Дане діагностичне речовина була вперше виділено в Російській Федерації з даної рослини методом колонкової хроматографії. Методом 1Н-ЯМР і мас-спектрометрії було встановлено хімічну будову виділеного з'єднання [6]. Порівняння отриманого нами домінуючого флавоноїду з ДСО рутином методом ТШХ (Rf близько 0,4), хроматографічна система хлороформ-метанол-вода (26: 14: 3) по хроматографічної рухливості показало, що виділене з'єднання має інше значення Rf близько 0,45. Виявлено, що нарціссін і рутин мають близькі спектральні характеристики [6, 7]. На наш погляд, це пояснює помилковий підхід до аналізу сировини календули, застосовуваний в зарубіжних фармакопеях, в яких вчені вказують на наявність рутина як діагностичного речовини квіток нагідок.
Достовірно відомо, що широкий спектр фармакологічної дії квіток календули (протизапальну, регенеруючу, антимікробну) обумовлений вмістом різних класів біологічно активних сполук (БАС), таких як каротиноїди, флавоноїди (глікозиди кемпферол, кверцетин і ізорамнетін), сапоніни [5]. На наш погляд, оптимальний підхід до стандартизації квіток календули повинен включати в себе аналіз сировини на вміст провідних груп біологічно активних речовин [8]. У зв'язку з цим нами раніше були розроблені методики якісного та кількісного аналізу квіток нагідок на вміст флавоноїдів з використанням методу ТШХ і спектрофотометрії [7]. Цей підхід був узятий пізніше за основу та іншими вітчизняними вченими [9]. Таким чином, аналіз літературних даних показує суперечливість підходів до аналізу квіток і препаратів календули лікарської, які орієнтовані на різні групи БАС (флавоноїди, фенілпропаноїди, сапоніни, каротиноїди, органічні кислоти), що не дозволяє об'єктивно оцінювати якість сировини і лікарських засобів даної рослини. Отже, на даний момент розробка методик стандартизації сировини і препаратів календули лікарської з використанням сучасних методів аналізу, включаючи високоефективну рідинну хроматографію (ВЕРХ), видається актуальним питанням.
Метою нашого дослідження є наукове обґрунтування підходів до стандартизації квіток календули лікарської і препаратів на основі даної сировини методом ТШХ, спектрофотометрії та високоефективної рідинної хроматографії.
матеріали та методи
Об'єктами дослідження були квітки календули лікарської, заготовлені в серпні 2013 року на фармакопейному ділянці Ботанічного саду Самарського державного університету, а також промислові зразки сировини.
У роботі були використані тонкослойная хроматографія, спектрофотометрія і високоефективна рідинна хроматографія. Реєстрацію УФ-спектрів проводили за допомогою спектрофотометра «Specord 40» (Analytik Jena). Повітряно-сухе рослинна сировина піддавали вичерпного екстрагуванню спиртом етиловим 70% в співвідношенні «сировину: екстрагент» - 1:30. Аналіз отриманих водно-спиртових витягів здійснювали за допомогою ТШХ на пластинках «Сорбфіл ПТСХ-АФ-А-УФ» в системі «хлороформ - метанол - вода» (26: 14: 3). Використовувалися стандартні зразки нарціссіна (3-O-рутинозид ізорамнетін), рутина (3-О-рутинозид кверцетину), кверцетину, ізокверцітрін і астрагалін. ВЕРХ-аналіз проводили на рідинному хроматографе «Biotronic».
Результати дослідження та їх обговорення
Результати порівняльного дослідження методом ТШХ свідчать про те, що на хроматограмах водно-спиртових витягів квіток календули домінуючим компонентом є нарціссін (3-O-рутинозид ізорамнетін), який при прояві хроматограми свіжоприготовленим розчином діазобензолсульфокіслоти виявляється у вигляді домінуючого плями жовто-оранжевого кольору з Rf близько 0,45. Дане діагностичне речовина була вперше виділено з даної рослини методом колонкової хроматографії. Методом 1Н-ЯМР і мас-спектрометрії раніше було встановлено хімічну будову [6]. Порівняння виділеного нарціссіна з ДСО рутином методом ТШХ (Rf близько 0,4) по хроматографічної рухливості показало, що отримане нами з'єднання має значення Rf близько 0,45. Нарціссін по відношенню до плями ДСО рутина має значення Rs близько 1,1. З огляду на порівнянної рухливості і близьких значень Rf і спектральних характеристик закордонні вчені беруть пляма нарціссіна за рутин (рис. 1), що знаходить відображення в помилкових методиках аналізу, включених до Європейської фармакопеї і в фармакопеї інших країн [1, 3, 9]. Розрахунок величини Rs дозволить підвищити об'єктивність методики для аналізованого речовини. Крім того, в цих же хроматографических умовах виявляється другий менш інтенсивне пляма речовини жовтого кольору з Rf близько 0,6, який відповідає ізокверцітрін.
Результати порівняльного дослідження електронних спектрів водно-спиртових витягів зразків квіток календули лікарської свідчать про те, що для всіх зразків сировини характерні максимуми поглинання при λmax 260 ± 2 нм (флавоноїди) і області 330-350 нм (флавоноїди і гідроксикоричні кислоти) (рис. 2 ). Крім того, для розчину вилучення в присутності AlClз спостерігається батохромний зсув в області 408 нм ± 2 нм (рис. 3), характерний для флавонолів з глікозильованого 3-ОН-групою. Важливо відзначити, що нарціссін і рутин, є 3-О-рутинозид ізорамнетін і кверцетину відповідно (рис. 1), близькі за своїми спектральним характеристикам - по коротковолновому і довгохвильовому максимуму поглинання (близько 258 нм і 360 нм) (рис. 4 і 5 ). Це знайшло підтвердження в умовах диференціальної спектрофотометрії: максимум поглинання в області 408-412 нм, що дозволяє рекомендувати як аналітичної довжини хвилі значення 412 нм.
Нарціссін (3-О-рутинозид ізорамнетін) жовті кристали з етилового спирту, С28Н32О16, т. Пл. 173-175ºС
Рутин (3-О-рутинозид кверцетину) жовтий кристалічний порошок C27H30O16, т. Пл. 192-196ºС.
Рис.1. Хімічні структури найважливіших флавоноїдів квіток календули лікарської
Дана обставина дозволила використовувати спектрофотометрію для кількісного визначення флавоноїдів в перерахунку на ДСО рутин.
Останнім часом для цілей стандартизації активно впроваджується метод ВЕРХ, що дозволяє одночасно здійснювати якісний і кількісний аналіз ЛРС. На наш погляд, в умовах ВЕРХ в якості маркера може виступати домінуючий флавоноид нарціссін. Результати ВЕРХ-аналізу свідчать про те, що в досліджуваних умовах хроматографування нарціссін добре відділяється від інших компонентів квіток календули лікарської, що дозволяє даний метод рекомендувати як для цілей ідентифікації сировини нагідок, так і для цілей стандартизації препаратів на основі сировини даної рослини.
Визначено, що зміст домінуючого з'єднання (нарціссіна) в добуванні квіток календули лікарської, встановлене методом ВЕРХ, варіює від 0,57 ± 0,02% до 0,72 ± 0,03%. У даних умовах в аналізованому витяганні також відзначається наявність флавоноїду рутина в достатній кількості (його зміст становить 0,21% ± 0,01%). Крім того, в мінорних кількостях виявляються изокверцитрин (0,06% ± 0,002%) і кверцетин (0,04% ± 0,001%).
Рис. 2. УФ-спектри розчинів водно-спиртових витягів з квіток календули лікарської. Позначення: 1 - розчин вилучення (1:30); 2 - розчин вилучення (1:30) з додаванням алюмінію хлориду
Рис. 3. УФ-спектр розчину водно-спиртового витягів з квіток календули лікарської (диференційний спектр)
Рис. 4. УФ-спектр розчину нарціссіна
Позначення: 1 - вихідний розчин; 2 - розчин з додаванням алюмінію хлориду
Рис. 5. УФ-спектр розчину рутина
Позначення: 1 - вихідний розчин; 2 - розчин з додаванням алюмінію хлориду
Таким чином, в ході дослідження розроблена методика кількісного визначення домінуючого флавоноїду нарціссіна методом обернено-фазової ВЕРХ. Зміст нарціссіна в квітках календули, встановлене з використанням даної методики, варіює від 0,57 ± 0,02% до 0,72 ± 0,03%.
З огляду на специфічність нарціссіна для квіток календули лікарської, вважаємо за доцільне використання методу ВЕРХ для визначення автентичності сировини і препаратів даної рослини по виявленню даного флавоноїду, що має діагностичне значення.
Необхідно відзначити, що в зарубіжних фармакопеях відсутній досвід використання ВЕРХ аналізу для стандартизації сировини календули [1, 3, 9, 10]. Важливо підкреслити, що в сучасній літературі зустрічаються дані щодо можливості застосування методу ВЕРХ аналізу для стандартизації сировини календули [4, 8]. За даними деяких авторів, аналіз вилучення квіток календули лікарської методом ВЕРХ необхідно проводити ідентифікацією кверцетину з визначенням висоти піку в даної речовини, а також з використанням ДСО кверцетину [8]. Крім того, кверцетин не є діагностичним речовиною для квіток календули лікарської, так як, по-перше, міститься в невеликій кількості, а по-друге, є найбільш поширеним флавоноїдного агликоном в рослинах. Інші дослідники в рамках проведення ВЕРХ-аналізу пропонують використовувати такі маркерні компоненти, як: тіфанеозід (ізорамнетін-3-О-α-L-рамнопіранозіл- (1 → 2) -α-L-рамнопіранозіл- (1 → 6) -β- D-глюкопіранозид), нарціссін, ізорамнетін-3-О-глюкозид і ізорамнетін-3-О-(6 '' - ацетил) -глюкозід [4]. Однак, незважаючи на чітке хроматографічне розділення компонентів вилучення з квіток нагідок, представляються некоректними міркування вчених щодо домінуючого компонента - тіфанеозіда (похідне ізорамнетін). В опублікованих результатах високоефективної рідинної хроматографії автори не пропонують конкретне діагностичне з'єднання, не проводять розрахунок вмісту домінуючого флавоноїду, а також не призводять методику кількісного визначення [4]. Мінорні кількості рутина на хроматограмі не узгоджуються з даними наших досліджень, а також з уявленнями, викладеними в Європейській і Британської фармакопеях [9]. Європейські фахівці вказують на наявність рутина як діагностичного речовини і в зв'язку з близькістю спектральних і фізико-хімічних характеристик рутина з нарціссіном не виявляється останнім в календулі лікарської. На наш погляд, домінуючим і діагностичним флавоноїдом є нарціссін, і визначення саме цього флавоноїду, в тому числі з використанням методу ТШХ і ВЕРХ, є доцільним для цілей стандартизації сировини і препаратів.
Висновки:
1. Розроблено нові підходи до стандартизації підходу до стандартизації квіток календули лікарської, які полягають в комплексному використанні спектрофотометрії, ТШХ і ВЕРХ.
2. З огляду на специфічність нарціссіна для квіток календули лікарської, вважаємо за доцільне використання методу ВЕРХ для визначення автентичності сировини і препаратів даної рослини по виявленню даного флавоноїду, що має діагностичне значення.
3. Розроблені підходи доцільно використовувати для цілей стандартизації препаратів на основі квіток календули лікарської як можливість реалізації принципу гармонізації в ряду «лікарську рослинну сировину - лікарський препарат».
рецензенти:
Шаталаев І.Ф., д.б.н., професор, завідувач кафедри хімії фармацевтичного факультету державного бюджетного освітньої установи вищої професійної освіти «Самарський державний медичний університет» Міністерства охорони здоров'я Російської Федерації, м Самара;
Правдивцева О.Е., д.фарм.н., доцент кафедри фармакогнозії з ботанікою і основами фітотерапії державного бюджетного освітньої установи вищої професійної освіти «Самарський державний медичний університет» Міністерства охорони здоров'я Російської Федерації, м Самара.
бібліографічна посилання
Куркіна А.В., Афанасьєва П.В., Куркін В.А., Платонов І.А., Павлова Л.В. ОБГРУНТУВАННЯ НОВИХ ПІДХОДІВ ДО СТАНДАРТИЗАЦІЇ СИРОВИНИ І ПРЕПАРАТІВ КАЛЕНДУЛИ ЛЕКАРСТВЕННОЙ // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2015. - № 5 .;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=21546 (дата звернення: 31.12.2019).
Пропонуємо вашій увазі журнали, що видаються у видавництві «Академія природознавства»
(Високий імпакт-фактор РИНЦ, тематика журналів охоплює всі наукові напрямки)
Ru/ru/article/view?