Відомо, що віруси здатні до фенотипической і генотипической мінливості і постійно формують небезпечні для людської популяції варіанти. Найбільшу проблему з точки зору епідеміології є мінливість вірусів грипу [4]. Одним з механізмів формування нових варіантів вірусу грипу є формування реассоціатов в результаті змішаного зараження. Найбільш частим джерелом утворення нових варіантів вірусу грипу А є водоплавні і інші птахи [1, 4].
На даний момент Всесвітньою організацією охорони здоров'я (ВООЗ) зафіксовано декілька варіантів вірусів грипу птахів, здатних інфікувати людину: штами вірусу грипу птахів А (H5N1) і A (H7N9) [1]. Вперше про зараження грипом птахів A (H7N9) людини було повідомлено 31 березня 2013 року органами охорони здоров'я Китаю, на сьогоднішній день в ВООЗ надійшли повідомлення про 453 лабораторно підтверджених випадків інфікування людей вірусом пташиного грипу A (H7N9), отримані від Національної комісії з охорони здоров'я і планування сім'ї КНР, від Гонконзького Центру з охорони здоров'я і від Центрів контролю захворювань Тайбея [1].
Незважаючи на незначну кількість повідомлень про зараження даним вірусом людини, вірус грипу птахів A (H7N9) викликає у лікарів занепокоєння в зв'язку з тим, що у більшості пацієнтів перебіг захворювання був у тяжкій формі і в 175 випадках мало летальний результат [1]. Таким чином, своєчасне пошук способів лікування даної інфекції є актуальним завданням.
Хіміопрепарати проти вірусу грипу представлені сполуками, які надають свій вплив на різні стадії реплікації вірусу грипу: препарати ремантадина блокують білок М2 вірусу грипу. Препарати занамівір і озельтамівір діють як інгібітори нейрамінідази. Відносно препаратів групи ремантадина можна відзначити їх високу токсичність і низьку ефективність, так як вони активні тільки щодо грипу А, але не проти грипу В. Інгібітори нейрамінідази є ефективними препаратами, але, маючи високу вартість, менш доступні для населення.
В організмі людини основною системою, відповідальною за боротьбу з вірусними інфекціями, є система інтерферону. В арсеналі сучасної медицини є препарати рекомбінантного інтерферону альфа-2b, широкий спектр противірусної активності яких характеризован в численних дослідженнях як in vitro, так і in vivo [5].
За даними різних дослідників ефективність терапії інтерфероном альфа-2b вірусних інфекцій можна значно підвищити за допомогою антиоксидантів [2, 3, 7, 8]. Вперше про синергизме інтерферону альфа-2b та антиоксидантів в терапії вірусних інфекцій повідомлялося в роботах В. В. Малиновської. За даними [7, 8] комбінація інтерферону альфа-2b та антиоксидантів iv vitro і in vivo має виражений синергічний ефект: в присутності антиоксидантів специфічна противірусна активність інтерферону збільшується в кілька разів, що дозволяє не тільки підвищити ефективність терапії, але і знизити можливість прояву побічних ефектів.
Метою цієї роботи було вивчення противірусної активності інтерферону альфа-2b як противірусного препарату по відношенню до вірусу грипу птахів A (H7N9) і оцінка впливу антиоксидантів на перебіг експериментальної інфекції in vitro.
Матеріали і методи дослідження
Культура клітин
Лінія клітин нирки зеленої мавпи Vero клон Е6, отримана з лабораторії культур тканин ФГБУ НДІ вірусології ім. Д. І. Іванівського. Культуру клітин вирощували в вигляді моношару в 96-ямковий планшетах при 37 ° С в атмосфері 5% СО2 з використанням середовища Голка МЕМ з додаванням антибіотиків (100 Од / мл пеніциліну і стрептоміцину 50 МО / мл), глутаміну 150 мкг / мл і 10% сироватки крові ембріонів корів (ростовая середа). В якості підтримуючої використовували середу Голка з додаванням антибіотиків (100 Од / мл пеніциліну і стрептоміцину 50 МО / мл), глутаміну 150 мкг / мл і 2% інактивованої при 56 ° С сироватки крові ембріонів корів.
вірус
Штам вірусу грипу птахів A / Anhui / 2013 (H7N9) отримано з лабораторії Державної колекції вірусів ФГБУ НДІ вірусології ім. Д. І. Іванівського. Для культивування використовували алантоїсну порожнину 9-10-денних курячих ембріонів.
препарати
- Інтерферон альфа-2b людський рекомбінантний, Р N003726 / 01, виробництва ТОВ «Фармапарк», Росія, активність 4 × 108 МО / мл. Має виражену противірусну, антипроліферативну та імуномодулюючу активність. Як референсу активності інтерферону альфа-2b людського рекомбінантного використовували міжнародний стандарт активності інтерферону (International Standard Interferon alpha 2b, NIBSC code: 95/566).
- Аскорбінова кислота (вітамін С), ЛС-000420, виробництва «ДСМ Нутрішнл Продактс (ЮК) Лімітед», Великобританія. Є високоактивним природним антиоксидантом, нейтралізує вільні радикали, має здатність відновлювати активну форму вітаміну Е.
- Аскорбат натрію, ЛС-000423, виробництва «ДСМ Нутрішнл Продактс (ЮК) Лімітед», Великобританія. Є натрієвої сіллю аскорбінової кислоти, має аналогічну біологічну активність з аскорбіновою кислотою, але на відміну від неї має менший поверхневим подразнюють.
- Альфа-токоферолу ацетат (вітамін E), dl-альфа-токоферолу ацетат, тип CWS / F500, водорозчинна форма, виробництва Sigma Aldridsch, США. Є високоактивним природним антиоксидантом і антигіпоксантів, нейтралізує вільні радикали і перекису жирних кислот, активні форми кисню, здатний запобігати перекисне окислення мембран клітин.
- Мексидол (етілметілгідроксіпірідіна сукцинат), P N002161 / 01, виробництва ТОВ «НПК Фармасофт», Росія. Є високоактивним синтетичним антиоксидантом, нейтралізує вільні радикали.
цитотоксичність
Оцінку цитотоксичности препаратів проводили за стандартною методикою [6] шляхом інкубації 1-добового моношару клітинної культури Vero клон Е6 з різними концентраціями препаратів протягом 72 годин в 96-ямковий планшетах при 37 ° С в атмосфері 5% СО2. Після інкубації клітини відмивали розчином Хенкса, для підрахунку кількості клітин використовували автоматичний лічильник клітин Cauntess, виробництва Invitrogen, США із застосуванням 0,4% розчину трипанового синього. За ЦД50 (50% тканинна цитопатичної доза) випробуваного зразка брали максимальну концентрацію, сприяє виживанню не менше 50% клітин в порівнянні з контролем. За МПК (максимально переносима концентрація) випробуваного зразка брали максимальну концентрацію випробуваного зразка, що не викликає видимих змін в життєздатності клітин.
антивірусна активність
Антивірусну активність оцінювали за рівнем придушення цитопатичної дії вірусу різними розведеннями препаратів і комбінацій на культурі клітин Vero клон Е6. Для роботи використовували 1-добовий моношар культури, вирощений в 96-ямковий планшетах. Множинність інфікування вірусу грипу птахів A / Anhui / 2013 (H7N9) склала 0,1 ТЦД50 на клітку, тривалість інкубації 48 годин при 37 ° С в атмосфері 5% СО2. За ІК50 (50% інгібуюча концентрація) брали концентрацію випробуваного зразка, при якій клітинна культура виявилася повністю захищеною від цитопатичної дії вірусу в 50% лунок.
Результати та обговорення
Вивчення цитотоксичної дії препаратів
Певні максимальні переносяться концентрації препаратів, що не роблять цитотоксичної дії на культуру клітин Vero клон Е6, наведені в табл. 1.
Для роботи на культурі клітин при визначенні антивірусної активності використовували концентрації препаратів менше або рівні МПК, зазначені в табл. 1.
Вивчення антивірусної активності препаратів
Певні для препаратів ІК50 щодо вірусу грипу птахів A / Anhui / 2013 (H7N9) представлені в табл. 1. Для оцінки можливої перспективи використання препарату в якості хіміотерапевтичного засобу щодо вірусної інфекції використовували поняття ХТИ (хіміотерапевтичний індекс) - відношення максимально переносної концентрації препарату до ІК50. Для ефективних противірусних препаратів величина ХТИ повинна бути більше 3. Отримані дані щодо антивірусної активності досліджуваних препаратів показують, що інтерферон альфа-2b людський рекомбінантний може бути використаний як засіб противірусної терапії інфекції, спричиненої вірусом грипу птахів A / Anhui / 2013 (H7N9) . Також показано, що антиоксидант Мексидол має слабко противірусну активність зі значенням ХТИ 4,0.
Вивчення антивірусної активності комбінацій препаратів
Для вивчення впливу антиоксидантів на антивірусну активність інтерферону альфа-2b готували розчини досліджуваних препаратів з різною концентрацією як інтерферону альфа-2b, так і антиоксидантів. Для оцінки ефективності комбінації використовували поняття фракційного ингибирующего коефіцієнта (ФВК), значення якого обчислювали за формулою (ІД50 - 50% інгібуюча доза):
При значенні ФИК 0,5 має місце помірний синергізм з'єднань, при значенні ФИК, рівному 1,0-1,5, має місце адитивний ефект комбінації, при значенні ФИК більше 2 має місце антагонізм з'єднань [9]. Результати оцінки впливу антиоксидантів на антивірусну активність інтерферону альфа-2b наведені в табл. 2.
З представлених даних видно, що антиоксиданти надають стимулюючу дію на противірусну активність інтерферону альфа-2b: в присутності різних концентрацій антиоксидантів ІК50 інтерферону альфа-2b знижується в 2 і більше разів. Так, наприклад, в присутності аскорбінової кислоти в концентрації 25 мкг / мл ІК50 інтерферону альфа-2b знижується в 8 разів, при використанні концентрації 2,5 мкг / мл - в 2 рази. У присутності аскорбата натрію в концентрації 25 мкг / мл ІК50 інтерферону альфа-2b знижується в 8 разів, при використанні концентрації 2,5 мкг / мл - в 4 рази. При використанні альфа-токоферолу ацетату в концентрації 25 мкг / мл і 2,5 мкг / мл ІК50 інтерферону альфа-2b знижується в 8 разів. При спільному використанні з мексидола в концентрації 25 мкг / мл ІК50 інтерферону альфа-2b знижується в 8 разів, при використанні в концентрації 2,5 мкг / мл - в 4 рази.
При аналізі ефекту комбінованого застосування антиоксидантів і інтерферону альфа-2b шляхом розрахунку ФИК отримані дані, що демонструють явно виражений синергічний ефект для всіх комбінацій, причому максимальний синергічний ефект спостерігали при комбінуванні з альфа-токоферолу ацетатом. Трохи менш виражений синергічний ефект спостерігали при спільному застосуванні інтерферону альфа-2b та аскорбінової кислоти, найменш виражений синергізм спостерігали для комбінації інтерферону альфа-2b та мексидола.
висновки
Інтерферон альфа-2b людський рекомбінантний є ефективним препаратом у відношенні вірусу грипу птахів A / Anhui / 2013 (H7N9), значення хіміотерапевтичного індексу препарату дорівнює 16. Застосування інтерферону альфа-2b в комбінації з антиоксидантами підвищує його ефективність щодо вірусу грипу птахів A / Anhui / 2013 (H7N9) в 8 разів, до величини хіміотерапевтичного індексу 128.
література
- Бюлетень ВООЗ «WHO RISK ASSESSMENT. Human infections with avian influenza A (H7N9) virus »від 02.10.2014 р
- Васильєв А. М. Оцінка впливу антиоксидантів на специфічну противірусну активність інтерферону алфьа-2 b людського рекомбінантного щодо вірусу простого герпесу в культурі клітин // Антибіотики і хіміотерапія. 2010. № 7. С. 20-25.
- Васильєв А. Н., Дерябін П. Г., галега Г. А. Протвовірусная активність антиоксидантів і їх комбінацій з інтерфероном альфа-2b людських рекомбінантним щодо вірусу грипу птахів А / H5N1 // Цитокіни і запалення. 2011. Т. 10. № 2. С. 32-36.
- Грип та інші респіраторні вірусні інфекції: епідеміологія, профілактика, діагностика і терапія / За ред. О. І. Кисельова, І. Г. Маринича, А. А. Сомініной. Монографія. СПб, 2003 244 с.
- Єршов Ф. І., Кисельов О. І. Інтерферони та їх індуктори (від молекул до ліків). М., 2005. 368 с.
- Керівництво з експериментального (доклінічного) вивчення нових фармакологічних речовин / Под ред. Р. У. Хабрієва. М., 2005.
- Темічева Е. В., Малиновська В. В., Манахова Л. С. та ін. // Питання вірусології. 1986. № 1. C. 12-18.
- Темічева Е. В. Інтерферонова статус при рецидивуючому герпесі геніталій і корекція його порушень. Автореф. дис. ... канд. мед. наук. М., 1989.
- De Clercq E., Sakuma T., Baba M., Pauwels R., Balzarini J., Rosenberg I., Holý A. Antiviral activity of phosphonylmethoxyalkyl derivatives of purine and pyrimidines // Antiviral research. 1987. Vol. 8. № 5-6. Р. 261-272.
П. Г. Дерябін1, доктор медичних наук, професор, академік РАПН
Г. А. галега, доктор медичних наук, професор
ФГБУ ФНІЦЕІМ ім. Н. Ф. Гамалії МОЗ РФ, Москва
1 Контактна інформація: pg_deryabin@mail.ru
Купити номер з цією статтею в pdf