Реферат: Електрофорез 2

1. Гомогенізація біологічного матеріалу
2. Метод заморожування і відтавання тканини
3. Екстракція білків, пов'язаних з мембранами, і руйнування олігомерних білків на протомери
4. Видалення з розчину небілкових речовин
5. Очищення білків виборчої денатурацією
6. висолювання
7. Гель-фільтрація, або метод молекулярних сит
8. ультрацентрофугування
9. електрофорез білків
10. ионообменная хроматографія
11. Аффинная хроматографія, або хроматографія по спорідненості
12. Очищення білків від низькомолекулярних домішок
13. Основні переваги системи електрофорезу на мікрочіпі:
14. мікрочіп MultiNA

зміст

Введення. 3

Принцип методу електрофорезу. 3

Фізико-хімічні властивості білків і методи їх виділення. 5

Методи виділення та очищення білків. 6

Методи руйнування тканин і екстракції білків. 6

Гомогенізація біологічного матеріалу. 6

Метод заморожування і відтавання тканини. 6

Екстракція білків, пов'язаних з мембранами, і руйнування олігомерних білків на протомери .. 7

Видалення з розчину небілкових речовин. 7

Методи очищення білків. 7

Очищення білків виборчої денатурацією. 8

Висолювання. 8

Гель-фільтрація, або метод молекулярних сит .. 9

Ультрацентрофугування. 10

Електрофорез білків. 12

Ионообменная хроматографія. 12

Аффинная хроматографія, або хроматографія по спорідненості. 14

Очищення білків від низькомолекулярних домішок. 15

Нуклеїнові кислоти .. 15

MultiNA - Система електрофорезу на мікрочіпі для дослідження нуклеїнових кислот. 16

Основні переваги системи електрофорезу на мікрочіпі:. 17

Мікрочіп MultiNA .. 18

Вступ

Електрофорез займає зараз центральне місце серед методів дослідження білків і нуклеїнових кислот. У сучасній науковій літературі рідко можна зустріти статтю, в якій би на тій чи іншій стадії фракціонування або характеристики цих біополімерів було змарновано електрофорез. Метод дозволяє розділяти макромолекули, що розрізняються за такими найважливішими параметрами, як розміри (або молекулярна маса), просторова конфігурація, вторинна структура і електричний заряд, причому ці параметри можуть виступати як порізно, так і в сукупності.

Принцип методу електрофорезу

Фізичний принцип методу полягає в наступному. Знаходяться в буферному розчині макромолекули мають деяким сумарним електричним зарядом, величина і знак якого залежать від рН середовища. Якщо через цей розчин, укладений в канал з ізолюючого матеріалу, наприклад, скляну трубку, почати пропускати електричний струм, то вздовж каналу встановиться певний градієнт напруги, т. Е. Сформується електричне поле. Його напруженість вимірюється різницею потенціалів на кінцях робочого каналу (або його ділянки), віднесеної до його довжини (В / см). Під дією поля макромолекули відповідно до свого сумарним зарядом мігрують в напрямку катода або анода, причому їх тертя об навколишнє середовище обмежує швидкість міграції. Залежно від величини заряду і розмірів молекули набувають різні швидкості, і в цьому - сутність процесу електрофорезу. Поступово вихідний препарат, що складався з різних молекул, розділяється на зони однакових молекул, мігруючих з однієї і тієї ж швидкістю. Згодом ці зони розподіляються по довжині каналу. В даний час майже виключно використовуються поліакриламідні гелі (ПААГ) і гелі агарози. Варіюючи концентрацію полімеру, можна отримувати гелі з дуже широким діапазоном розмірів пір. Крім того, можна змінювати електричні заряди макромолекул шляхом варіації рН буфера, а їх конфігурацію шляхом введення в буфер денатуруючих агентів або детергентів. Все це надає методу електрофорезу виняткову гнучкість.

В ході електрофорезу зони розчинених макромолекул залишаються невидимими. Для спостереження за процесом в вихідний препарат додають барвник, молекули якого несуть електричний заряд того ж знака, що і фракціоніруемие макромолекули, але не взаємодіють з ними. Барвник теж пересувається в електричному полі, але вже у вигляді забарвленої зони. Його підбирають таким чином, щоб швидкість міграції найбільш рухливих макромолекул була дещо нижчою, ніж у молекул барвника. Коли пофарбована зона доходить до кінця трубки, електрофорез припиняють.

Розділились зони біополімерів щоб уникнути їх дифузії негайно фіксують. Для цього гель витягають зі скляної форми і вимочують в суміші кислоти зі спиртом так, що білки або нуклеїнові кислоти випадають в осад у тому самому місці, де закінчилася їх міграція в ході електрофорезу. Після фіксації (або одночасно з нею) проводять фарбування зон шляхом вимочування гелю в розчині барвника, міцно зв'язується з білком або нуклеїнової кислотою. Надлишок барвника видаляють.

Замість циліндричних часто використовують гелі у вигляді тонких пластин, заполімерізованние між двома плоскими стеклами. Такі пластини мають важливу перевагу: на них можна одночасно Фракціоновані кілька препаратів. Зазвичай їх вносять з одного краю гелю на рівних відстанях один від одного. Кожен препарат розділяється в електричному полі незалежно від своїх сусідів, утворюючи свій набір зон. Замість фарбування або поряд з ним часто використовують методи виявлення розділених зон по їх радіоактивності. До них відносяться прийоми реєстрації смуг на фотоплівці за допомогою авторадиографии або флюорографії і різні способи рахунку радіоактивності в гелі за допомогою рідинних сцинтиляційних лічильників.

Фракционированием в ПААГ і агарозе не вичерпуються сучасні методи електрофорезу. Як «носіїв» рідкої фази широко використовують також плівки з ацетату целюлози, фільтрувальну папір, тонкі шари силикагеля, целюлози, сефадексе і ін. В деяких випадках, наприклад для поділу низькомолекулярних речовин, ці системи мають свої переваги, проте для фракціонування білків, нуклеїнових кислот і їх фрагментів в даний час використовують майже виключно гель-електрофорез

Фізико-хімічні властивості білків і методи їх виділення

Важливе місце в біохімічних дослідженнях займає виділення індивідуальних білків з органів і тканин. Очищені індивідуальні білки потрібні для вивчення їх первинної структури, отримання кристалів білків з метою дослідження їх просторової структури методом рентгеноструктурного аналізу, встановлення взаємозв'язку між первинною, просторовою структурою білка і його функцією.

Деякі очищені індивідуальні білки використовують в медицині як лікарські препарати, наприклад гормон інсулін застосовують для лікування цукрового діабету, а травні ферменти підшлункової залози призначають при порушенні її функцій як замісна терапія. Крім того, очищені ферменти часто використовують в біохімічних дослідженнях в якості хімічних реактивів для визначення речовин в біологічних рідинах.

Більшість методів, використовуваних для очищення індивідуальних білків, засноване на відмінностях їх фізико-хімічних властивостей, а також можливості специфічно зв'язуватися з лігандом.

Отримання індивідуальних білків з біологічного матеріалу (тканин, органів, клітинних культур) вимагає проведення послідовних операцій, що включають:

· Дроблення біологічного матеріалу і руйнування клітинних мембран;

· Фракціонування органел, що містять ті чи інші білки;

· Екстракцію білків (переклад їх в розчинений стан);

· Поділ суміші білків на індивідуальні білки.

Для руйнування біологічного матеріалу використовують методи: гомогенізації тканини, метод змінного заморожування і відтавання, а також обробку клітин ультразвуком.

Гомогенізація біологічного матеріалу

Тканина, що знаходиться в буферному розчині з певним значенням рН і концентрацією солей, поміщають в скляну посудину (гомогенізатор) з товкачем. Обертається товкач подрібнює і розтирає тканину про притертою стінки судини.

Метод заморожування і відтавання тканини

В результаті поперемінного заморожування і відтавання утворюються кристали льоду руйнують оболонки клітин.

Після руйнування тканини нерозчинні частини осаджують центрифугуванням. Подальше центрифугування гомогенату з різною швидкістю дозволяє отримати окремі фракції, що містять клітинні ядра, мітохондрії та інші органели, а також супернатант, в якій знаходяться розчинні білки цитозоля клітини. Шуканий білок буде міститися в одній з цих фракцій.

Екстракція білків, пов'язаних з мембранами, і руйнування олігомерних білків на протомери

Якщо шуканий білок міцно пов'язаний з будь-якими структурами клітини, його необхідно перевести в розчин. Так, для руйнування гідрофобних взаємодій між білками і ліпідами мембран в розчин додають детергенти; найчастіше використовують тритон Х-100 або додецилсульфат натрію.

При дії детергентів зазвичай руйнуються і гідрофобні взаємодії між протомеров в олігомерних білках.

Видалення з розчину небілкових речовин

Нуклеїнові кислоти, ліпіди та інші небілкові речовини можна видалити з розчину, використовуючи їх Особливі фізико-хімічні властивості. Так, ліпіди легко видаляються з розчину додаванням органічних розчинників, наприклад ацетону. Однак вплив має бути короткочасним, так як ацетон викликає денатурацію деяких білків. Нуклеїнові кислоти осаджують додаванням в розчин стрептоміцину.

Найбільш трудомісткий етап отримання індивідуальних білків - їх очищення від інших білків, що знаходяться в розчині, отриманому з даної тканини. Часто досліджуваний білок присутній в невеликих кількостях, що становлять частки відсотка від усіх білків розчину.

Так як білки володіють конформационной лабільністю, при роботі з білками слід уникати денатуруючих впливів, тому виділення і очищення білків відбуваються при низьких температурах.

На перших стадіях очищення білків доцільно використовувати методи, що враховують будь-яку характерну особливість даного білка, наприклад термостабільність або стійкість в кислих розчинах. Першими методами очищення необхідно видалити з розчину основну масу баластних білків, які значно відрізняються від виділяється білка фізико-хімічними властивостями. Згодом застосовують все більш тонкі методи очищення білка.

Очищення білків виборчої денатурацією

Більшість білків денатуруючих і випадає в осад вже при короткочасному нагріванні розчину до 50-70 ° С або підкисленні розчину до рН 5. Якщо виділяється білок витримує ці умови, то за допомогою виборчої денатурації можна видалити більшу частину сторонніх білків, відфільтрувавши випали в осад-білки , або осадити їх центрифугуванням.

висолювання

Метод очищення білків, заснований на відмінностях в їх розчинності при різній концентрації солі в розчині. Солі лужних і лужно-земельних металів викликають оборотне осадження білків, тобто після їх видалення білки знову набувають здатність розчинятися, зберігаючи при цьому свої нативні властивості.

Найчастіше для поділу білків методом висолювання використовують різні концентрації солей сульфату амонію - (NH4) 2 SO4. Чим вище розчинність білка, тим більша концентрація солі необхідна для його висолювання.

Гель-фільтрація, або метод молекулярних сит

Для поділу білків часто використовують хроматографічні методи, засновані на розподілі речовин між двома фазами, одна з яких рухома, а інша нерухома. В основу хроматографических методів покладено різні принципи: гель-фільтрації, іонного обміну, адсорбції, біологічного спорідненості.

Метод поділу білків за допомогою гель-фільтраційної хроматографії заснований на тому, що речовини, що відрізняються молекулярною масою, по-різному розподіляються між нерухомою і рухомою фазами. Хроматографічна колонка заповнюється гранулами пористого речовини (сефадексе, агароза і ін.). У структурі полісахариду утворюються поперечні зв'язки і формуються гранули з "порами", через які легко проходять вода і низькомолекулярні речовини. Залежно від умов можна формувати гранули з різною величиною "пір".

Нерухома фаза - рідина всередині гранул, в яку здатні проникати низькомолекулярні речовини і білки з невеликою молекулярною масою. Суміш білків, нанесену на хроматографічну колонку, вимивають (елюіруют), пропускаючи через колонку розчинник. Разом з фронтом розчинника рухаються і найбільші молекули.

Більш дрібні молекули дифундують всередину гранул сефадексе і на деякий час потрапляють в нерухому фазу, в результаті чого їх рух затримується. Величина пір визначає розмір молекул, здатних проникати всередину гранул.

Так як гелева структура сефадексе легко деформується під тиском, гелі стали замінювати більш жорсткими матрицями (сефактіл, той-сперлася), що представляють сферичні гранули з різними розмірами пор. Вибір розмірів пір в гранулах залежить від цілей хроматографії (про інших хроматографічних методах буде сказано нижче).

ультрацентрофугування

Метод поділу також заснований на відмінності в молекулярних масах білків. Швидкість седиментації речовин в процесі обертання в ультрацентрифуге, де відцентрове прискорення досягає 100 000-500 000 g, пропорційно їх молекулярній масі. На поверхню буферного розчину, поміщеного в кювету, наносять тонкий шар суміші білків. Кювету поміщають в ротор ультрацентрифуги. При обертанні ротора протягом 10-12 год більші молекули (з більшою молекулярною масою) осідають в буферному розчині з більшою швидкістю. В результаті в кюветі відбувається розшарування суміші білків на окремі фракції з різною молекулярною масою Після розшарування білкових фракцій дно кювети прокаливают голкою і по краплях збирають вміст невеликими порціями в пробірки.

Поділ суміші білків методом гель-фільтрації.

Кювету, заповнена буферним розчином з розділеними білковими фракціями.

електрофорез білків

Метод заснований на тому, що при певному значенні рН і іонної сили розчину білки рухаються в електричному полі зі швидкістю, пропорційною їх сумарному заряду. Білки, які мають сумарний негативний заряд, рухаються до анода (+), а позитивно заряджені білки - до катода (-).

Електрофорез проводять на різних носіях: папері, крохмальної гелі, поліакриламідному гелі та ін. На відміну від електрофорезу на папері, де швидкість руху білків пропорційна тільки їх сумарному заряду, в поліакриламідному гелі швидкість руху білків пропорційна їх молекулярним масам.

Роздільна здатність електрофорезу в поліакриламідному гелі вище, ніж на папері. Так, при електрофорезі білків сироватки крові людини на папері виявляють тільки 5 головних фракцій: альбуміни, α1 глобуліни, α2-глобуліни, β-глобуліни і γ-глобуліни (рис. 1-57). Електрофорез тих же білків в поліакриламідному гелі дозволяє отримати до 18 різних фракцій. Для виявлення білкових фракцій смужки паперу або стовпчики гелю обробляють барвником (найчастіше бромфенолового синім або Амідова чорним). Пофарбований комплекс білків з барвником виявляє розташування різних фракцій на носії.

ионообменная хроматографія

Так само як і електрофорез, метод заснований на поділі білків, що розрізняються сумарним зарядом при певних значеннях рН і іонної сили розчину. При пропущенні розчину білків через хроматографічну колонку, заповнену твердим пористим зарядженим матеріалом, частина білків затримується на ньому в результаті електростатичних взаємодій.

В якості нерухомої фази використовують ионообменники - полімерні органічні речовини, що містять заряджені функціональні групи.

Розрізняють позитивно заряджені аніонообменнікі, серед яких найбільш часто використовують діетіламіноетілцеллюлозу (ДЕАЕ-целюлозу), що містить катіонні групи, і негативно заряджені катіонообмінники, наприклад карбоксиметилцеллюлозу (КМ-целюлозу), що містить аніонні групи.

Вибір іонообмінника визначається зарядом виділяється білка. Так, для виділення негативно

Електрофорез білків сироватки крові здорової людини на папері.

зарядженого білка використовують аніонообменнік. При пропущенні розчину білка через колонку міцність зв'язування білка з аніонообменнікі залежить від кількості негативно заряджених карбоксильних груп в молекулі. Білки, адсорбовані на аніонообменнікі, можна змити (елюіровать) буферними розчинами з різною концентрацією солі, найчастіше NaCI, і різними значеннями рН. Іони хлору зв'язуються з позитивно зарядженими функціональними групами анионообменника і витісняють карбоксильні групи білків. При низьких концентраціях солі елюіруются білки, слабо пов'язані з аніонообменнікі. Поступове збільшення концентрації солі або зміна рН, що змінює заряд білкової молекули, призводить до виділення білкових фракцій, в одній з яких знаходиться шуканий білок.

Аффинная хроматографія, або хроматографія по спорідненості

Це найбільш спеціфічній метод віділення індівідуальніх білків, Заснований на виборчих взаємодії білків з лігандамі, прікріпленімі (іммобілізованімі) до твердого носію. Як лиганда может буті використаних субстрат або кофермент, если віділяють будь-якої фермент, антигени для віділення Антитіл и т.д. Через колонку, заповнений імобілізованім лигандом, пропускають розчин, что містіть суміш білків. До ли-Ганді приєднується тільки білок, специфічно взаємодіє з ним; всі інші білки виходять з Елюат. Білок, адсорбований на колонці, можна зняти, промивши її розчином зі зміненим значенням рН або зміненої іонною силою. У деяких випадках використовують розчин детергенту, що розриває гідрофобні зв'язку між білком і лігандом.

Аффинная хроматографія відрізняється високою вибірковістю і допомагає очистити виділяється білок в тисячі разів.

Аффинная хроматографія.

нуклеїнові кислоти

Нуклеїнові кислоти - це біополімери, макромолекули яких складаються з багаторазово повторюваних ланок - нуклеотидів. Тому їх називають також полинуклеотидами. Найважливішою характеристикою нуклеїнових кислот є їх нуклеотидний склад. До складу нуклеотиду - структурної ланки нуклеїнових кислот - входять три складові частини:

· Азотистих основ - піримідинові або пуриновое. У нуклеїнових кислотах містяться підстави 4-х різних видів: два з них відносяться до класу пуринів і два - до класу піримідинів. Азот, що міститься в кільцях, надає молекулам основні властивості.

· Моносахарид - рибоза або 2-дезоксирибоза. Цукор, що входить до складу нуклеотиду, містить п'ять вуглецевих атомів, тобто є пентозу. Залежно від виду пентози, присутньої в нуклеотиде, розрізняють два види нуклеїнових кислот - РНК (РНК), які містять рибозу, і дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК), що містять дізоксірібозу.

· Залишок фосфорної кислоти. Нуклеїнові кислоти є кислотами тому, що в їх молекулах міститься фосфорна кислота. Нуклеотид - фосфорний ефір нуклеозиду. До складу нуклеозиду входять два компоненти: моносахарид (рибоза або дезоксирибоза) і азотистих основ.

Поєднання технології електрофорезу на мікрочіпі, автоматизованої пробоподготовки і чутливого флуоріметріческого детектування пропонує високоефективну заміну традиційному агарозному гель-електрофорезу. Якісний і кількісний аналіз нуклеїнових кислот стає тепер як ніколи швидким, недорогим і високоточним. В даний час при проведенні досліджень нуклеїнових кислот основним методом вивчення розподілу фрагментів ДНК і РНК за молекулярною масою (об'ємом) залишається агарозній гель-електрофорез. До основних недоліків цього методу слід віднести досить високу вартість аналізу при використанні готових пластин гелю, високу трудомісткість, пов'язану з великою кількістю ручних операцій, тривалість аналізу, необхідність використання додаткового вельми дорогого устаткування для візуалізації і наступної цифрової обробки електрофореграм, використання небезпечних для здоров'я реагентів ( бромистого етидія). Всіх цих недоліків позбавлена ​​остання розробка компанії Shimadzu - прилад для електрофоретичного розділення нуклеїнових кислот з використанням мікрочіпа MCE®-202 MultiNA.

Основні переваги системи електрофорезу на мікрочіпі:

- Низька вартість аналізу. Конструкція і матеріал мікрочіпа дозволяють використовувати його для кількох тисяч аналізів, при цьому використовується вкрай незначна кількість витратних матеріалів. Тим самим досягається істотне зниження вартості (в 1,5 - 3 рази) одного аналізу ДНК у порівнянні з агарозній гель-електрофорезом. Якщо порівнювати систему електрофорезу на мікрочіпі з існуючими зараз на ринку системами капілярного електрофорезу, то зниження вартості аналізу може досягати 6 і більше разів. У разі аналізу РНК економія може бути ще більш істотною (розраховане, виходячи з вартості обладнання та реагентів на японському ринку).

- Висока швидкість аналізу. Високошвидкісний автоматизований аналіз до 108 зразків (96 + 12 додатково). З використанням одного мікрочіпа повний цикл аналізу ДНК становить 255 секунд. Для збільшення продуктивності в прилад може бути встановлено до чотирьох мікрочіпів для паралельної роботи. В цьому випадку час одного аналізу скорочується до 75 секунд.

- Висока чутливість. Флуоріметріческій детектор з фотоумножителем і джерелом збудження флуоресценції на основі світлодіода забезпечує приблизно 10-кратне збільшення чутливості в порівнянні з традиційним фарбуванням бромистим етидієм (дані отримані в ході внутрішніх випробувань в лабораторії Shimadzu). До того ж використовувані флуоресцентні барвники, такі як SYBR green II і SYBR gold, абсолютно нешкідливі для здоров'я на відміну від бромистого етидія.

- Висока роздільна здатність і прекрасна відтворюваність аналізу. Оптимальна конфігурація капілярів мікрочіпа і спеціально підібраний склад буферного розчину забезпечують чудові характеристики електрофоретичного розділення нуклеїнових кислот. Завдяки автоматизованій системі пробоподготовки кількість ручних операцій зведено до мінімуму. Внутрішні маркери молекулярної ваги вже включені в набори реагентів і використовуються при кожному аналізі. Все це в комплексі істотно збільшує надійність і відтворюваність отриманих результатів. Прилад може комплектуватися чотирма різними наборами реагентів для аналізу ДНК різного розміру і РНК

- Простота використання. Програмне забезпечення з дружнім призначеним для користувача інтерфейсом і великою кількістю функцій максимально спрощує проведення дослідження. Оператору досить завантажити зразки і реагенти в прилад, поставити в програмі бажану послідовність аналізу зразків і клікнути по іконці «Старт» на екрані комп'ютера. Все інше, включаючи обробку електрофореграм, прилад виконає в автоматичному режимі.

мікрочіп MultiNA

Мікрочіп, виготовлений з кварцу високої чистоти, включає мікроемкості для завантаження зразка та реагентів і електрофоретичний канал 23 × 0,09 × 0,05 мм (д × ш × г). Напруга подається за допомогою напилювання платинових електродів. Канал і мікроемкості виконані з високою точністю за допомогою унікальної фотолітографії технології Shimadzu. Спеціальне покриття забезпечує можливість багаторазового використання одного і того ж мікрочіпа (~ 3600 аналізів). Наслідком малої довжини електрофоретичного каналу і його оптимальної форми є неперевершена на сьогоднішній день швидкість електрофоретичного розділення нуклеїнових кислот. Набори реагентів для аналізу ДНК і РНК. Прилад може комплектуватися трьома наборами реагентів для аналізу ДНК різного розміру і набором реагентів для аналізу РНК.