Вісімдесят п'ять мишей піддалися виживання хірургічної техніки, описаної в цьому звіті для інфраренального черевної аорти затиску. Загальна виживаність склала 85,9%. Оперативні ускладнення включали кишкова кровотеча і велику перфорацію судин, що призводить до 5,9% і 3,5% відповідно смертності (таблиця 1). Після виходу з наркозу, миші нормально ходити і не виявляють жодних ознак ішемічного пошкодження нижніх кінцівок. Не було відзначено зниження ваги або відсутність апетиту.
Фігури 1А і 1В показують зображення інфраренального черевної аорти наступні лапаротомії і заочеревинного розсічення під стереомикроскопа без (а) і з (В) аортального затиску. Як показано, життєво важливо, щоб затиснути ширину аорті у всій її повноті, щоб забезпечити оголення уздовж ширини аорти. Наш протокол виявив, що використання різкий вигин Шварца Micro Серрштрафи з шириною притиску 1,75 мм і "сильною" зажим преси справив найбільше безперервну рану по всій ширині аорти з мінімальними витратами часу затиску. Проте, інші затискачі були випробувані в кількох тимчасових інтервалах оклюзія зі змінними розмірами пошкодження (Малюнок 1C). Решта результатів представлені були отримані з використанням згаданого вище затиску.
Гістологічне дослідження аорти демонструє повне оголення ендотеліальної вистилки з помірним ушкодженням підстильної клітин гладких м'язів шару, про що свідчить H & E фарбування. Оголення ендотелію відбувається на обох 10 сек і 10 хв, хоча і в різному ступені (малюнок 2). Для визначення оптимального аортального інтервалу часу зажимное необхідне для повного артеріальної денудации, миші піддавалися затискним протягом 10 сек, 1 хв і 10 хв і негайно убивали для аналізу, як описано в наведеному вище протоколі. ЯвляютсяА денудации зростала зі збільшенням затиску тайминги (рисунок 3). На 10 сек, неповної і осередкове денудационного травми приблизно 0,75 мм 2 був ідентифікований плямистий фібриногену фарбування, де фібриногену служить в якості маркера для травми денудационного. Через десять хвилин аорти затиску проводиться повністю зачищений ендотеліальної площа близько 1,2 мм 2, однак ця кількість часу затиску було розглянуто високий ризик ішемії кінцівки і реперфузійного пошкодження. Таким чином, ми вважали 1 хв аорти затиску достатньою, який справив площа 0,88 мм 2 денудаційні в середньому, щоб привести до майже повної травми артерій денудационного без ознак ішемічного пошкодження.
Ступінь пошкодження денудации з 1 хв аорти затиску надзвичайно відтвореним, виробляючи діаметр 600 мкм і 0,88 мм 2 площа денудации (Малюнки 3 і 4). Інтенсивність забарвлення фібриногену є достатнім для ідентифікації початкового ушкодження в більш пізні моменти часу. На малюнку 4 показані фібриногену фарбування трьох мишей, які пройшли 1 хв аортальной затиску 24 години до умертвіння, створюючи високовоспроізводімого травми. Вимірювання фібриногену фарбування через 24 години після травми шести аорті становить приблизно 0,81 мм 2 (рис 5А), статистично подібний травми на 0,88 мм 2 відзначено відразу після травми (р = 0,14). У порівнянні з неушкодженою ендотелій, рана запас 24 год після травми показує мігруючими ендотеліальні клітини з верхніх фібриногену фарбування, маркування повторно ендотеліалізацію в денудационного травми (рис 5B). В середньому, повної перемотуванням ендотеліалізацію травми денудации 0,88 мм 2 зайняв приблизно 3 дні. Тим не менш, цей підхід може бути додатково пристосований для отримання ще більших травм денудации. Затискні кілька разів, каждийв протягом 1 хв, від ростральної до хвостового уздовж інфраренального аорти отримують травми денудации 3,7 мм 2. Хоча цей підхід також ушкоджує слизову ЗМІ, ми ніколи не спостерігали розсічення черевної аорти в результаті травми затиску.
Цей протокол показує, що інфраренальном черевного відділу аорти затиску можна безпечно проводити в мишачої моделі для цілей створення травми денудации артеріального і вимірювання ендотеліальної регенерації.
Малюнок 1:. Ізольовані інфраренальном черевну аорту Ізольовані інфраренальном черевної аорти показаний без (А) і з (В) судинного затиску. Були використані кілька затискачів різної довжини і затиск прес сили, щоб вибрати той, який пропонує послідовну травми (C). Шварц Micро судинний затискач (стрілка) справила великий безперервну рану. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.
Малюнок 2: Ефективність Ендотеліальна Денудація H & E фарбування в інфраренального черевної аорти секції в непошкодженій миші (А) і через 10 секунд (B) і 10 хв аорти затиску (С) .. Судинний затиску повністю оголює ендотеліальний шар, як можна перевірити відсутністю ядер фарбування. Крім того, втрата ядер клітин гладких м'язів показує, ушкодження середньої частини оболонки. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.
Рис.3: Відносини затиску Час Загоєння Довжина
інфраренальном черевної аорти затиску проводили протягом 10 сек, 1 хв і 10 хв. Відразу після травми, іммуноцітохіміі була виконана в фас до операції фіктивного і ці тимчасові точки, як показано на малюнку (A) і з більш високою роздільною здатністю (B). Фібриноген (в фіолетовому) ідентифікує область травми. β-катенин (в червоному кольорі) ідентифікує ендотеліальні кордону. Зірочка (*) позначає область застосування затиску. Відсутність -катеніна означає відсутність ендотеліальних клітин в області пошкодження. (С) використовують фібриноген фарбування в якості маркера денудации області травми, щоб показати, що збільшення часу затиску збільшує площу денудацією (п = 2 для кожної тимчасової точки). Стовпчики помилок позначають стандартне відхилення. Будь ласка , натисніть годину ERE для перегляду збільшеної версії цієї фігури.
Рис. 4: Визначення травми Площа Двадцять чотири години після затиску аорти протягом 1 хвилини, аорта була розчленована і розрізають, щоб оголити внутрішньої оболонки. Після фіксації в 4% параформальдегід, іммуноцітохіміі була виконана анфас. Фібриноген (в фіолетовому) ідентифікує область травми (А). Більш високе збільшення маржі рани (B) і в межах рани (C) показані. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.
Малюнок 5: Відтворюваність денудаційні Травма і ідентифікація Re-ендотелізаціі. Двадцять чотири години після травми, аорта була розчленована, як зазначено і піддався іммуноцітохіміі анфас. Використання фібриногену в якості маркера для травми денудационного, спостерігається дуже відтворювані травми в (A) з середньою площею денудации 0,81 мм 2 (п = 6). Більш високі дозвіл зображення показують, що запас рани проявляє фібриногену фарбування і мігруючі ендотеліальні клітини (стрілки, фіолетовий фарбування) (B) в порівнянні з неушкодженою ендотелій (C). Стовпчики помилок позначають стандартне відхилення. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.
Таблиця 1:. Оперативна і післяопераційної летальності в цілому 85 мишей Underwлор виживання infrafrenal черевної аорти затиску з виживанням 85,9%. Вісім мишей (9,4%) не вижила операцію через кишкову кровотечею або перфорацією великої судини. Чотири миші померли в післяопераційному періоді.
