Синтез білків - справа нехитра. У самому примітивному варіанті для цього достатньо нагріти суміш сухих амінокислот до 150 ° С. Через кілька годин утворюються ланцюжки поліпептидів довжиною до 250 амінокислотних залишків, частина з яких проявляє слабку ферментативну активність. У колби бажано додати глину: її частки адсорбують амінокислоти і працюють як каталізатор. Щоб отримати таким способом примітивну живу клітину, необхідні сущі "дрібниці" - кілька мільярдів колб і кілька мільярдів років.
У 2004 році, приблизно через чотири мільярди років після появи на Землі перших полінуклеотидних і поліпептидних ланцюжків, їх нащадки з Медичного інституту Говарда Хьюза при Університеті Вашингтона під керівництвом Девіда Бейкера синтезували перший рукотворний білок Top7. На відміну від природи, що діє методом проб і помилок, вчені спочатку змоделювали білок на комп'ютері, від послідовності амінокислот до тривимірної структури молекули, а потім чисто хімічним шляхом, без генів і рибосом, синтезували послідовність з декількох десятків амінокислот.
Ланцюжок амінокислот - це тільки напівфабрикат. Властивості білків визначає не стільки їх хімічний склад, скільки тривимірна структура їх молекул.
Щоб відтворити процес, з яким жива клітина справляється за лічені хвилини, синтезуючи тисячі, а то й десятки тисяч молекул одночасно, колективу вчених потрібні були роки. Тільки моделювання фолдинга - згортання молекули білка в тривимірну структуру - на одному комп'ютері зайняло б близько ста років, і для розрахунків використовували програму Folding @ Home - один з найбільших проектів розподілених обчислень: на момент закінчення розрахунків по Top7 в ньому брало участь понад півмільйона комп'ютерів. Програма працює у фоновому режимі, практично не впливаючи на загальну продуктивність процесора.
Якщо ви належите до числа щасливчиків, які мають необмежений доступ до Інтернету, - приєднуйтесь. Число вакансій не обмежена. Методику автори збираються використовувати для дослідження білків (в першу чергу - бета-амілоїду, накопичення якого відбувається при хворобі Альцгеймера) і для конструювання білків з заданими властивостями, необхідних медицині.
напівсинтетична напівжиття
Найпримітивніша життя - це вірус, а найпримітивніша з відомих вірусоподоб них частинок з довгою назвою "віроїди кокосової пальми каданг-каданг" складається всього з 246 нуклеотидів. Однонітевую кільце РНК віроідов не містить навіть справжніх генів, що кодують білки. Відповідно у них немає білкової оболонки, що дозволяє ввести генетичний матеріал через неушкоджену клітинну стінку.
Геном найбільш простих вірусів містить всього три гени, які кодують білки, необхідні для відтворення: білок, що викликає розрив клітинної стінки господаря; фермент, що забезпечує багаторазову реплікацію свого генома, і білок капсида - оболонки, що покриває вірусну ДНК або РНК. Приклад такого вірусу - бактеріофаг Qβ, що інфікує кишкову паличку Escherichia coli. Його РНК складається приблизно з 3500 нуклеотидів. Найбільші віруси містять дві-три сотні генів, закодованих в двухцепочечной нитки ДНК довжиною в кілька сотень тисяч пар нуклеотидів.
Методи виробництва штучних вірусів вже розроблені: для цього потрібно запрограмувати послідовність нуклеотидів, синтезувати окремі ділянки ДНК або РНК довжиною в кілька десятків нуклеотидів і з'єднати їх між собою.
Перший синтетичний вірус створила група дослідників з Університету штату Нью-Йорк під керівництвом Екарда Віммера. Насправді цей вірус був у всіх відносинах полусинтетическим. По-перше, це було не щось нове, а точна копія натурального вірусу поліомієліту. По-друге, ділянка РНК або ДНК, що містить потрібну послідовність нуклеотидів, - приблизно те ж саме, що дискета, на якій записана програма для автоматизованої виробничої лінії. Зчитування інформації, синтез нових копій вірусної РНК і білків капсида і збірка вірусних частинок - складний процес, для якого вірус використовує ферменти і органели клітини-господаря. Чисто хімічними методами теоретично можна синтезувати і РНК поліовірусу (приблизно сім тисяч нуклеотидів), і кожен з вхідних в капсид білків, але зібрати їх в єдину конструкцію без допомоги живої клітини неможливо. Спробуйте (зрозуміло, подумки) розібрати на деталі що-небудь нескладне начебто запальнички або кулькової ручки, скласти деталі в коробку і трясти, поки вони не будуть зігнані в чинне виріб.
Для синтезу РНК вірусу група Віммера використовувала натуральні клітинні ферменти; для синтезу білків і збірки вірусних частинок - екстракти з живих клітин, що містять необхідні для синтезу компонентів і складання вірусів рибосоми, ферменти, нуклеотиди, амінокислоти, транспортні РНК і т.д.
У листопаді 2003 року дослідницька група з Інституту альтернативних біологічних джерел енергії під керівництвом знаменитого Крейга Вентера (засновника і колишнього керівника компанії "Селера джиномикс", яка прославилася успіхами в розшифровці генома людини) оголосила про нове досягнення. Вченим вдалося реконструювати бактеріофаг φX174, кільцева одноцепочечная ДНК якого містить 11 генів в послідовності з 5386 нуклеотидів. Віммер на синтез поліовірусу знадобилося три роки; Вентер і його колеги після річної підготовки зібрали вірус за два тижні. Введений в бактерію, синтетичний вірус нормально розмножувався, а його нащадки самостійно заражали клітини кишкової палички.
Одне з найбільш очевидних застосувань синтетичних вірусів - створення бактеріофагів, спроможних вбивати хвороботворні бактерії. Такі віруси будуть найкращим засобом боротьби з інфекціями, ніж антибіотики. Повністю штучні або генетично модифіковані віруси можна використовувати і для доставки генів у хромосоми при генної інженерії та генетичної терапії спадкових хвороб.
мінімізована бактерія
Зараз Вентер і його колеги, в число яких входить лауреат Нобелівської премії Хемілтон Сміт, працюють над створенням - за допомогою тієї ж технології штучного мікроорганізму на основі Mycoplasma genitalium - умовно-патогенного мешканця сечостатевих шляхів. Хромосома середньої бактеріальної клітини містить дві-чотири тисячі генів. Геном M. genitalium складається всього з 517 генів, 480 з яких кодують білки, а 37 - різні молекули РНК. Найближчий родич M. genitalium, M. pneumoniae, містить ті ж 480 генів плюс ще близько 200 додаткових. Для виживання найпростішої "версії" мікроорганізму ці гени не є обов'язковими. Акуратно, один за іншим, вирізаючи гени з хромосоми M. genitalium, дослідники встановили, що в її лаконічному геномі тільки близько 300 генів дійсно необхідні для існування бактерії в живильному бульйоні.
Проект "Мінімальний геном" спрямований на створення найпростішого з найпростіших життєздатного одноклітинного організму. Після цього можна буде проводити "апгрейдинг пристрої з мінімальною конфігурацією". У звичайній бактеріальної клітці надлишкова продукція природних метаболітів або синтез білка, закодованого в трансгенних, конфліктує з основними програмами, записаними в тисячах генів і забезпечують виживання клітини в природних умовах. У клітці з мінімальним геномом всі ресурси, крім необхідних для життя і ділення в тепличних умовах біореактора, будуть спрямовані на синтез необхідних людині білків.
Роботи Вентера і Сміта фінансуються спеціальним грантом Міністерства енергетики США в розмірі 3 млн доларів. Міністерство розраховує, що з часом проект буде мати практичний вихід, наприклад для створення нових мікроорганізмів, здатних переробляти токсичні відходи виробництва або виробляти водень і інші види палива.
Набір "зроби сам"
Вчені з нью-йоркського Університету імені Рокфеллера під керівництвом Альберта Лібхабера і Вінсента Нуар підійшли до конструювання штучної клітини з іншого боку. Вони не зменшують існуючий геном, а конструюють клітці "з нуля". Теоретично всі складові частини діючої моделі клітини можна було б синтезувати з простих органічних молекул, але простіше взяти деталі з живих джерел.
Спочатку в двошарову оболонку з фосфоліпідів, виділених з курячого яйця, дослідники ввели гомогенізоване клітинне вміст кишкової палички (за винятком хромосоми і плазмід). Крім того, у внутрішнє середовище штучних клітин додали отриманий з вірусу фермент, що забезпечує синтез ДНК. Але сама по собі фосфолипидная оболонка у живих клітин служить тільки каркасом клітинних мембран, а двосторонній транспорт речовин через мембрани забезпечує складний комплекс білкових молекул. І для процесів клітинного синтезу необхідна керівна і спрямовуюча роль хромосоми. Без неї везикули (мікропухирці) першої моделі могли існувати не більше п'яти годин, після чого транспорт амінокислот і рибонуклеотидов через фосфоліпідну стінку і синтез з них білків і обривків нуклеїнових кислот припинялися.
Експериментатори додали в вміст везикул фрагменти ДНК. Виділений з медузи ген зеленого флуоресцентного протеїну часто використовують в якості маркера: якщо клітини світяться, значить, трансгенна конструкція вбудована в хромосому і додаткові гени обробляються як свої. Другий ген, виділений з золотистого стафілокока, кодує трубчасті молекули білка альфа-гемолизина. Цей білок вбудовувався в фосфоліпідний бішар, і отвори, що утворилися забезпечували транспорт речовин через мембрану. В результаті псевдожізнь штучних клітин подовжилася до чотирьох діб. За їх "загибеллю" можна було стежити за припинення світіння.
У 2004 році тільки в США створенням штучного життя займалися більше 100 лабораторій, а Європейський союз виділив 9 млн доларів на проект "Програмована еволюція штучної клітини", в тому числі на відкриття в Венеції першого інституту по створенню штучного життя - Європейського центру живих технологій.
Гени за рецептом
Генетично модифіковані тварини, від світяться акваріумних рибок до кіз і корів, доящіхся "олюдненим" молоком з підвищеним в тисячу разів вмістом заліза, вже перестали викликати містичний трепет. І навіть генетична модифікація людини - вже доконаний факт.
Правда, до реальної можливості появи підвидів Homo novus, позбавлених багатьох недоліків Homo sapiens і навіть пристосованих для виконання певних робіт, ще далеко, хоча в прогнозах футурологів всерйоз обговорюються більш-менш реальні удосконалення, які непогано було б ввести в людський організм, а в фантастичних романах можна знайти сотні варіантів модифікованих людей, в тому числі і явно гумористичних, начебто четвероруких космічних монтажників або сантехніків з пальцями, які заміняють гайкові ключі.
Але перш ніж надавати людині нові корисні властивості, слід позбавити його від старих і шкідливих. І не все людство одразу, а окремих його представників, яким особливо не пощастило з генами.
За досить обережними оцінками, половина всіх хронічних хвороб, якими років до п'ятдесяти обзаводиться кожен з нас, мають спадкову природу. Схильність до багатьох звичайним хворобам, від артриту до виразки, обумовлена поєднанням особливостей більш-менш стандартних відхилень в безлічі генів. Спроби виправити їх - справа безнадійна, у всякому разі - в доступному для огляду майбутньому.
Але багато хвороб є наслідком мутації в одному-єдиному гені, в результаті чого порушується або повністю відсутній синтез закодованого в цьому гені білка. Імовірність народження дитини з однієї з таких хвороб може бути досить високою: сімейна гіперхолестеролемія, що призводить до розвитку важкого атеросклерозу в ранньому віці, зустрічається у однієї людини з 500, серповидноклітинна анемія - у одного з 400 чистокровних африканців. Найрідше (приблизно у одного зі ста мільйонів новонароджених) зустрічається прогерія - хвороба, при якій в 7-10 років дитина починає катастрофічно швидко старіти і через кілька років помирає від старості. Сумарна ймовірність народження дитини з однієї з відомих моногенних хвороб становить близько одного відсотка. Якщо додати до цього ймовірність протягом життя захворіти однією з тих хвороб, для яких доведена роль певної модифікації певного гена, стане ясно, чому розробкою методів генотерапіі займаються сотні лабораторій, а клінічні випробування вже проходять сотні методик генетичної терапії різних видів злоякісних новоутворень, гемофілії, СНІДу, муковісцидозу, гіперхолесте ролем, бічного аміотрофічного склерозу і десятків інших хвороб.
Кращий вектор (засіб доставки) генів в ДНК людини та інших тварин - це непатогенні або знешкоджені віруси.
У червні 2005 року з'явилося повідомлення, що в Пенсильванському університеті (США) створено гібрид двох смертельно небезпечних вірусів, призначений для генної терапії муковісцидозу - невиліковного спадкового захворювання. Для цього важкого захворювання характерна підвищена в'язкість слизу, зокрема в бронхах і кишечнику, що призводить до порушення роботи багатьох органів і перш за все систем дихання і травлення. Винуватець муковісцидозу - ген, який кодує виробництво білка, що регулює проходження іонів натрію і хлору через клітинну мембрану. Щоб зупинити хворобу, необхідно скоригувати дефектний ген в значному числі клітин. Було вирішено використовувати для цього вірус імунодефіциту людини, який вміє додавати гени в ДНК клітин. Природно, вірус модифікували таким чином, щоб він не міг розмножуватися і викликати СНІД. Однак сам по собі вірус імунодефіциту не здатний проникати в клітини легеневого епітелію, які більше за інших потребують генетичному лікуванні. Щоб правильно націлити його, використовували білкову оболонку вірусу Ебола, що вміє з'єднуватися з потрібними клітинами. Випробування на мишах і мавпах показали високу ефективність гібридного вірусу: правильний ген вдалося впровадити майже в чверть клітин легеневого епітелію. Однак вилікуватися раз і назавжди таким способом неможливо. Вірус виправляє геном тільки в поверхневих клітинах легеневого епітелію, і лікування необхідно повторювати кілька разів на рік, у міру відмирання клітин.
При синдромі важкого комбінованого імунодефіциту (ТКІД) через порушення синтезу ферменту аденозіндезамінази в організмі накопичуються аденозин і дезоксиаденозин, токсична дія яких призводить до загибелі Т-і В-лімфоцитів. Таких хворих називають "діти в міхурі": без лікування для них смертельна будь-яка інфекція, і єдиний спосіб продовжити їхнє життя, крім генотерапіі, - це повна ізоляція від зовнішнього світу в стерильній камері. Частота захворювання - приблизно один з мільйона новонароджених. Перша спроба лікування двох дівчаток, хворих ТКІД, була зроблена в 1990 році: в хромосоми їх власних Т-лімфоцитів ввели ген аденозіндезамінази, модифіковані клітини розмножили і ввели в кістковий мозок пацієнток. На жаль, єдиний доступний метод доставки генів в лімфоцити або кровотворні стовбурові клітини - за допомогою ретровірусу - у двох з дюжини пролікованих таким способом дітей викликав рак крові. Правда, після всебічного обговорення більшість фахівців вирішили, що ризик в даному випадку виправданий: гарантія смерті при відсутності лікування - це ще гірше, ніж ймовірність лейкозу.
Для доставки терапевтичних генів в клітини застосовують також конструкції на основі аденовірусів (лейкозом вони не загрожують, але можуть викликати виражений імунну відповідь і загибель клітин, які отримали терапевтичний ген). При захворюваннях нервової системи (деякі пухлини, хвороби Альцгеймера і Паркінсона, розсіяний склероз та інші хвороби, пов'язані з порушенням синтезу певного білка) хорошим засобом доставки генів може служити знешкоджений вірус герпесу. Він легко заражає клітини нервової тканини і, на відміну від "дикого" типу, не викликає ні оперізуючого лишаю, ні енцефаліту.
Звучить все це і обнадійливо, і в той же час моторошно: як би віруси, навіть модифіковані, не привели до небажаних побічних ефектів.
Невірусніх способів доставки генів у Клітини існує много. Клоновані в бактеріальніх плазмидах гени можна вводіті прямо в тканини с помощью ін'єкцій. Можна бомбардувати клітини шкіри (або, через розріз, більш глибокі тканини) за допомогою генного "рушниці" мікрочастинками золота, до яких приєднані ділянки ДНК. Можна вводити відрізки ДНК в ліпосоми, які повністю поглинаються клітинами, або з'єднувати з антитілами, специфічними до білків потрібного типу клітин (наприклад, ракових). Але при всіх цих методах в ядра клітин потрапляє лише незначна частина лікувальних генів, а в хромосоми такі гени практично не вбудовуються - відповідно і потрібний білок синтезується дуже недовго.
Але навіщо взагалі вбудовувати нові гени в старі хромосоми? Адже можна без вірусів, генних рушниць і тому подібного побудувати нові хромосоми і вже їх ввести в клітини!
Мікрохромосоми для макроорганізму
Як і при конструюванні штучних клітин, при створенні мікрохромосом людини і тварин дослідники застосовують два протилежні підходи. Перший підхід - це створення штучних хромосом "з нуля", за допомогою синтезу. Таким шляхом йдуть більшість наукових груп, що працюють в цій галузі. Інший підхід передбачає, що основу штучних хромосом складають елементи нормальної хромосоми тварин, наприклад миші.
Штучні хромосоми дріжджів застосовуються в молекулярної біології вже давно, головним чином для клонування (отримання безлічі ідентичних копій) генів інших еукаріотичних організмів. Перші штучні хромосоми людини з'явилися в кінці XX століття. Така хромосома повинна містити службові елементи: теломери (кінцеві ділянки, які відіграють важливу роль в реплікації ДНК), точки ініціації реплікації (подвоєння хромосом) і центромеру (структуру, до якої при діленні клітини прикріплюються нитки, розтягують парні хромосоми). Все інше - терапевтичні гени, один або більше, або кілька копій одного гена, щоб синтез закодованого в ньому білка йшов інтенсивніше.
І в культурі клітин, і в організмі штучні хромосоми поводяться так само, як звичайні: вони подвоюються при діленні клітин і зберігаються у всіх нащадків вихідної клітини. Клітина не робить різниці між своїми і "прийомними" хромосомами, і закодований в додаткових хромосомах білок справно синтезується.
В одному з дослідів в кровотворні стовбурові клітини миші ввели штучні хромосоми, що несуть ген еритропоетину - білка, який сприяє утворенню еритроцитів і застосовується при лікуванні анемій. Контрольній групі мишей ввели клітини з такими ж додатковими хромосома ми, але "порожніми", що містять тільки службові гени. Як і очікувалося, у мишей дослідної групи вміст еритроцитів в крові було значно вище в порівнянні з тваринами контрольної групи.
Створення штучних хромосом людини, які несуть правильну версію гена для лікування спадкових захворювань (або гени терапевтичних білків в разі неспадкових хвороб), - справа найближчого майбутнього. Ряд дослідників розцінюють штучні хромосоми як самий багатообіцяючий метод застосування ген-модифікованих стовбурних клітин для лікування захворювань людини.
Вводити хромосоми в ядро можна буде або уклавши їх в контейнери-ліпосоми, або за допомогою ін'єкцій голкою атомно-силового мікроскопа. Японські нанотехнології в листопадовому номері журналу "Nano Letters" за 2004 рік опублікували статтю, в якій описаний зонд довжиною 8 мікрометрів і шириною 200 нанометрів. В оболонці ядра клітини після проколу такої голкою утворюється пролом діаметром 1 мікрометр, яка зникає після вилучення голки. Таким способом можна проводити нанохірургіческіе операції з генетичним матеріалом безпосередньо в живих клітинах без порушення цілісності їх мікроструктур.
Зрозуміло, перш ніж вводити в організм людини клітини з додатковою парою хромосом, цей метод слід ретельно перевірити на тварин. І взагалі, з можливостями генної інженерії і клітинної терапії пов'язані як великі надії, так і серйозні побоювання: будь-яке відкриття, починаючи з дубини і вогню, люди примудрялися використовувати не тільки на користь, але і на шкоду ближньому своєму, іншим божим створінням і біосфері в цілому. Але до сих пір баланс добра і зла від множення знання був позитивним - давайте екстраполюємо цю тенденцію і залишимо за кадром можливі негативні наслідки розвитку біотехнології.
Більш детальну інформацію див. На сайті http://www.cbio.ru
Підписи до ілюстрацій
Іл. 1. Моделювання просторової структури білків - не просте завдання. Щоб прискорити складні розрахунки, дослідники використовують програму розподілених обчислень. Це дозволяє залучити до участі в проекті сотні тисяч комп'ютерів, в тому числі домашніх. Тривимірна модель білка, над якою йде робота, з'являється на екрані монітора в якості заставки.
Іл. 2. Бактеріофаг φX174 (на малюнку представлена його об'ємна модель) містить всього 11 генів. Відносна простота цього мікроорганізму дозволила американським вченим під керівництвом Крейга Вентера "зібрати" його в лабораторії з окремих "деталей".
Іл. 3. Мікроорганізм Mycoplasma genitalium, представлений на фотографії, зробленої за допомогою електронного мікроскопа, містить всього 517 генів, з яких лише 300 мають критичне значення для виживання в лабораторних умовах. Саме цей організм став прототипом синтетичної "мінімальної клітини", над створенням якої працюють вчені.
Іл. 4. Штучні клітини-везикули, що складаються з фосфоліпідної пористої оболонки, всередині якої укладено фрагменти ДНК медузи, здатні світитися зеленим світлом. Це світіння є доказом того, що всередині штучних клітин йде синтез білка.
Іл. 5. Організм дітей з вродженим важким комбінованим імунодефіцитом беззахисний перед будь-якою інфекцією, тому дитина може вижити тільки в стерильному боксі. Американський хлопчик Девід Веттер, що народився в 1971 році, провів в пластиковому "міхурі" 12 років, після чого йому зробили пересадку кісткового мозку - на жаль, невдало. Генна терапія дає таким дітям надію на одужання.
Іл. 6. На фото білою стрілкою показана штучна міні-хромосома (поки без справжніх генів, що кодують білки). На її створення дослідникам з Мельбурна (Австралія) було потрібно 10 років. Такі міні-хромосоми вважаються дуже перспективними для доставки в клітку потрібних генів.
Але навіщо взагалі вбудовувати нові гени в старі хромосоми?