Як приклад в типовому використанні цих вірусів, вірус потрійний флуоресценції-репортер був використаний для порівняння точку гальмування кількох чітко визначених інгібіторів поксвірусних.
HeLa клітини висівають в культурі тканини обробляли чорні стінами чіткі плоским дном 96-ямковий та інкубували протягом ночі. Конфлюентние моношару були заражені при множинності інфекції (MOI) 10, використовуючи або потрійний репортер вірус (TRPV; Таблиця 1) або промотор-менш Венера (PLV), як описано на тарілці карті (рис. 1). Зараження середовищ, що містять процедури був доданий, щоб отримати кінцеву концентрацію 0,1% ДМСО, 3,6 мкМ (1 мкг / мл) AraC, 50 мкм (11,7 мкг / мл) IBT, 5 мкм (1,9 мкг / мл) ST-246 або 60 мкМ (50 мкг / мл) Рифампіцин в трьох примірниках. 0,1% ДМСО використовували в якості контролю транспортного засобу, так як все інгібітора запаси були використані в 1 мкл / мл в ДМСО. Планшет повернувся до 37 ° C incubatoг до 18 HPI. Клітини фіксували протягом 15 хвилин додаванням 100 мкл 8% PFA в усі лунки і зберігається в PBS в захищеному від світла, поки не зчитували на планшет-рідері. Показання флуоресценції проводили з використанням планшет-рідера Tecan Infinite M1000 і я-програмне управління (v1.5.14.0) донними читання 4 пункту на лунку в порушенні: довжин хвиль випромінювань 515: 530, 587: 610, 415: 457 нм для Венери, mCherry і TagBFP флуорофор, відповідно. До остаточних вимірювань, приріст був оптимізований, щоб дозволити максимальний сигнал без насичення датчиків (приріст був, як правило, 235, 255, 235 для зеленого, червоного і синього вимірювань, відповідно).
Малюнок 1. Представник розташування інфекцій і лікарської терапії на 96-ямковий планшет. Діаграма 96-а пластина інфекції і невеликий схеми складання молекула, використовуваного для кресть репрезентативні результати. Тримісний люмінесцентні вірус (TRPV; світлий сірий), що виражає раннє Венера, проміжний mCherry, і пізно TagBFP або промоутер-менш Венеру (PLV; темніше сірий) використовуються в колонках потрійні. 1-β-D-арабінофуранозілцітозіна (AraC), ізатин β-тіосемікарбазон (IBT), рифампіцин, ST-246 і ДМСО керування транспортним засобом з випробуваною концентрації вказані на малюнку справа. Натисніть тут, щоб подивитися збільшене зображення.
Відносні одиниці флуоресценції (RFU) на кожній повторності були нормалізовані для кожного каналу. По-перше, інтенсивність флуоресценції засіб для PLV лунок вичитали з середньої інтенсивності TRPV свердловин для кожної обробки, щоб врахувати інтенсивність фону, внесеного кожного препарату. Далі, це значення ділили на тлі віднімається середнє значення інтенсивності ДМСО оброблених TRPV свердловин (зростання дикого типу). Отримані результати після лікування з відомим роінгібітори xvirus узгоджується з раніше опублікованими висновками і їх розумів механізму дії. Припинення транскрипції гена раннього і переходу до експресії гена проміжного було показано, вимагають реплікації ДНК 17. Відповідно до цього, AraC, інгібітор реплікації ДНК, показали різке збільшення експресії раннього гена (210% ДМСО лікувати на ранніх стадіях вираження; рис. 2) і повна відсутність проміжного і пізній вираз (0,4% і 0,3% ДМСО оброблених проміжний і пізній вираз відповідно; рис. 2). Хоча точний механізм дії не визначений для IBT, вважається, сприяти читання через транскрипцію, що призводить до збільшення кількості дсРНК, активації РНКази L шляху і апоптозу 18-20. У відповідь на лікування IBT поступово важкий фенотип спостерігався в якому проміжний і пізній вираз були значно менше, ніж тільки ДМСО (24,7% і 2,9% ДМСО лікування для середнього і пізнього вираження, відповідно; Малюнок 2). Послідовно, але не є статистично значущим рано флуоресценції зниження спостерігалося також; Однак цього, швидше за все через IBT-індукованого апоптозу в цьому пізньому етапі (74,0% ДМСО при 18 HPI). На відміну від AraC і IBT, поксвирусов препарати ST-246 і рифампіцин обидва інгібують після кінця експресії генів під час віріона збірки і дозрівання 15,16. Ніяких змін в експресії генів не спостерігалося на всіх етапах, коли клітини обробляли або ST-246 (100,9%, 98,5% і 94,5% ДМСО лікування на ранній стадії, проміжної і пізньої експресії відповідно; фіг.2) або рифампіцин (107,6%, 104,2%, 106,5% та ДМСО лікування на ранній стадії, проміжний і пізній вираз, відповідно).
.. Онг> Малюнок 2 Стадія гальмування в результаті поксвірусних противірусних препаратів HeLa клітини були інфіковані і обробляють, як описано в представницьких результатів розділ А) Графік, що показує відносні одиниці флуоресценції (РФС ;. фон віднімається кожен канал на основі зростання PLV для кожного лікування і нормалізується щоб TRPV + ДМСО) для раннього (зелений), проміжний (червоний), і в кінці (синій) вірусна вираз. Клітини вирощували в присутності зазначених сполук для 0-18 HPI. Середнє зі стандартним відхиленням показано на чотири біологічних повторює кожен, виконаних в трьох примірниках. Один зразок Т-тести проводилися для кожної обробки і ДМСО пари каналів і статистично значущих відмінностей позначені зірочкою (* р <0,05, *** р <0,0005). B) Зображення кожну лунку обробки при 18 HPI. Всі зображення були захоплені з 10X мети на Zeiss 200M епіфлуоресцентной мікроскопа і експозицій масштабних аналогічно. Масштабної лінійки = 100 мкм.files / ftp_upload / 51522 / 51522fig2highres.jpg "цільових =" _blank "> Натисніть тут, щоб подивитися збільшене зображення.
Історично склалося так, поєднання низької MOI (0,01-0,1 PFU / клітина) і високою MOI (5-10 PFU / клітина) Аналізи зростання використовуються при дослідженні інгібуючу дію нової малої молекули або вірусної мутанта. При низькій МВС, габаритні ингибирующие ефекти часто перебільшені навіть незначного гальмування, так як тільки підмножина клітин спочатку інфіковані. При спробі визначити точку під час інфекції циклу, при якому вірус пригнічується, висока МВС інфекції, швидше за все, більш відповідним, так як всі клітини заражаються вашої первинної інфекції. Експеримент показано на Фіг.3 проводили, як на малюнку 2, з додаванням безлічі свердловин, які були інфіковані при більш низькій MOI = 1. В якості інгібітора, який функціонує посттранскрипційна, ST-246 не повинен впливати на будь-яку стадію експресії генів; однак, ясно, що, коли тільки підмножина осередків infecteд (рис. 3, МВС = 1) є очевидно інгібування всіх етапах вираження (38,4%, 48,9%, і 52,9% ДМСО в порівнянні з 100,9% , 98,5% і 94,5% для МВС = 1 vs МВС = 10 Рівень інфекції раннього, середнього і пізнього вираження, відповідно; рис. 3). Припускаючи, 100% -ве пригнічення зрілого віріона формування по ST-246, це означає, 100% клітин були інфіковані MOI = 10 інфекцій, а десь між 50 і 70% клітин були інфіковані продуктивно при MOI = 1 інфекції.
Малюнок 3. Вплив рівня інфекції на гадану гальмування ST-246. HeLa клітини, інфіковані як показано на малюнку 2 як з високою (МВС = 10) і низькою (МВС = 1) TRPV обробляють ST-246. Відносні одиниці флуоресценції (РФС; фон віднімається кожен про засновану каналан зростання PLV для кожного лікування і нормалізується до TRPV + ДМСО) для раннього (зелений), проміжний (червоний), і в кінці (синій) вірусна вираз в клітинах, інфікованих на будь-якому МВС = 1 або МВС = 10 і обробляють 20 мкМ ST- 246. Натисніть сюди, щоб подивитися збільшене зображення.
TRPV Тримісний вірус; C11R (Раннє) сприяли Венеру,
G8R (середній) сприяло mCherry, F17R (пізній) сприяли mTagBFP 7 PLV Промоутер-менш Венера Є.В. C11R (Раннє) сприяли Венеру IV G8R (середній) сприяло Венера LV F17R (пізній) сприяли Венеру Irev G8R (середній) сприяло mCherry і C11R (Раннє) сприяли Венеру LREV F17R (пізній) сприяли mCherry і C11R (Раннє) сприяли Венеру LR F17R (пізній) сприяли mCherry mCherry-A4L N-термінал злиття флуорофор VENUS в кінці висловив вірусного білка ядра A4L
Таблиця 1. Список штамів репортер вірусу вакцини. Таблиця опису флуоресценції репортера віруси.
