130 років тому людству відкрився один з механізмів роботи мозку: була виявлена «перегородка» між мозком і кровоносною системою тіла - гематоенцефалічний бар'єр.
Поява блакитного забарвлення тканин мозку у дорослому (праворуч) і у новонародженої (зліва) щурів на тлі розвитку інсульту та введення барвника Evans blue.
Легкі флуоресцентні мітки (декстран 3 кДа) розподілені по-різному: у дорослої щури (зліва) - розподіл по всьому мозку, а у новонародженої (праворуч) - концентрування в посудині на тлі розвитку інсульту мозку.
Експресія структурних білків гематоенцефалічного бар'єру - окклудіна і Клаудина-5 у новонароджених і дорослих щурів (темніші смужки відображають більш високу експресію).
<
>
Гематоенцефалічний бар'єр - тонка фізіологічна організація - залишався поза увагою вчених до тих пір, поки не стало очевидно, що саме він гальмує успіхи сучасної медицини і саме в його роботі приховані ресурси для нової епохи в фармакології. За останні 20 років в світі було синтезовано більше 40 нових препаратів, з яких всього два - для лікування хвороб мозку. Гематоенцефалічний бар'єр створює для деяких речовин «зелений» коридор, але для цілого ряду препаратів він залишається непроникним, і тому лікарі беззбройні в боротьбі з багатьма неврологічними патологіями, такими, наприклад, як інсульт мозку. Завдання проникності бар'єру встала, коли було визнано, що у новонароджених це захворювання зустрічається так само часто, як у дорослих.
Десять років тому діагноз «інсульт» дітям ставили вкрай рідко. Сьогодні прогрес у розвитку безпечних технологій для внутрішнього дослідження мозку (візуалізація) дозволив дослідникам побачити серйозність проблеми. Особливість дитячого інсульту в тому, що він проходить найчастіше безсимптомно або «маскується» під інші захворювання. Наслідки катастрофічні для дитини. У більшості маленьких пацієнтів виникають серйозні порушення: затримка розумового і мовного розвитку, гіперреактивність, труднощі в концентрації уваги, у них страждають логіка і адаптація до стресів, що не відразу і не очевидно проявляється в перші дні життя.
Але діагностика інсульту мозку у новонароджених - лише перший етап. Головне питання - як лікувати і як попередити це захворювання. Дитячий і дорослий інсульти - різні! Ми знаємо, які фактори провокують розвиток інсульту у дорослих - наприклад гіпертензія. Але для малюків ці фактори не так актуальні, і навіть такі очевидні на перший погляд причини, як родові травми, не ввійшли до лідируючої десятки провокаторів інсульту у дітей.
Чому інсульти мозку у новонароджених та дорослих так різняться? Після появи на світ мозок дитини ще продовжує розвиватися, причому особливо інтенсивно в перші дні після народження. На даний момент не існує тактики лікування інсульту мозку у новонароджених. Мало знаючи про це захворювання у немовлят, лікарі змушені застосовувати до них терапію, показану для дорослих. Вона виявляється неефективною, а іноді навіть заважає одужанню. Успіх в лікуванні таких дітей - часто випадковість, а не результат заздалегідь спланованою тактики лікаря.
Виникло припущення, що багато препаратів, які існують в арсеналі лікаря для лікування інсульту, просто не доходять до мозку новонародженого через примхливого гематоенцефалічного бар'єру, який закривається і не дає попрацювати препаратів.
Незважаючи на проривні технології в візуалізації структур мозку, вирішення проблем дитячого інсульту не було, тому що не вистачало відповідного інструментарію для дослідження «воріт», пропускають ліки в гематоенцефалічний бар'єр.
В експериментальній медицині платформа для вивчення будь-яких хвороб - моделювання патології на тварин. Серед існуючих на сьогоднішній день моделей інсульту жодна не придатна для новонароджених.
Є два типи інсульту - ішемічний, коли судини мозку звужуються, що обмежує його харчування і кровопостачання, і геморагічний, коли судини рвуться без явних на те причин. У новонароджених переважає другий тип інсульту. Однак моделі, що традиційно застосовуються для вивчення геморагічного інсульту, працюють за принципом механічного введення крові в мозок експериментальних тварин, що сильно обмежує дослідні можливості.
На біологічному факультеті Саратовського державного університету ім. Н. Г. Чернишевського розробили модель інсульту, за допомогою якої можна побачити, як судини мозку розриваються самостійно, без додаткових втручань. Для цього використовується звуковий стрес (120 дБ, 7 Гц). Звукові хвилі за рахунок здатності глибоко проникати в мозок порушують центри регуляції його кровотоку.
Судинні «катастрофи» у новонароджених трапляються не відразу, а через два-три дні після народження. Аналогічні зміни відбуваються з судинами лабораторних тварин після впливу звукового стресу. І хоча звук - це неадекватний провокуючий фактор для дитячого інсульту, на сьогоднішній день це єдина модель, яка дозволяє вивчати розвиток даної патології без інвазивних втручань, запускаючи внутрішні патологічні процеси, максимально наближені до природного ходу подій.
Однак для дорослих тварин простого стресу недостатньо, щоб викликати інсульт головного мозку. Для них потрібна наявність хронічно високого артеріального тиску, зношуються судини і робить їх стрес-нестійкими. Для того щоб вивчати, як працює «бар'єр» на перших етапах життя і на наступних етапах розвитку, ми озброїлися сучасними методами флуоресцентного виявлення білків окклудін і Клаудина-5, що працюють «митниками» на кордоні між мозком і кров'ю. Скористалися і старим методом вивчення проходження бар'єру барвником Evans blue (блакитний Еванса), що зв'язуються з білками крові. Саме цей барвник в 1885 році допоміг відкрити гематоенцефалічний бар'єр німецькому нейрофізіологу Паулю Ерліху. Коли він ввів барвник в кров, то виявив, що всі внутрішні органи забарвилися, а мозок немає. Пізніше досліди повторив його учень Едвін Голдман, але він вводив барвник вже безпосередньо в спинномозковий канал лабораторного тварини. Мозок ставав синім, при цьому вся фарба залишалася в ньому, не проникаючи на периферію. І до цього дня барвник Evans blue - надійний спосіб перевірки роботи гематоенцефалічного бар'єру. Звичайно, з'явилися й інші, більш точні способи тестування проникності бар'єру, наприклад світяться мітки, закріплені на полисахаридах - декстранами різної маси (3 кДа і 70 кДа).
А тепер подивимося, як працює гематоенцефалічний бар'єр при розвитку геморагічного інсульту і як ці процеси відрізняються один від одного в перші дні після народження лабораторного тваринного і в подальшому його розвитку.
Виявилося, внутрішньовенне введення барвника щурам на тлі розвитку інсульту супроводжується появою блакитного забарвлення тканин мозку тільки у дорослих, але не у новонароджених особин.
Ми досліджували, які речовини проходять через гематоенцефалічний бар'єр в умовах, коли організму необхідно боротися з інсультом. Для цього використовували флуоресцентні мітки - легкі (декстран 3 кДа) і важкі (декстран 70 кДа), які своїм світінням підказують нам їх місцезнаходження і допомагають визначити шлях руху.
Як виявилося, у дорослих щурів мозок при інсульті як решето: пропускає навіть високомолекулярні сполуки (декстран 70 кДа). А у новонароджених декстрановій флуоресцентні мітки застряють в судинах: бар'єр закривається так щільно, що навіть низькомолекулярні з'єднання (декстран 3 кДа) залишаються в межах судин і не потрапляють в мозок.
Використовуючи метод иммуноблоттинга (метод визначення специфічних білків), вдалося побачити білки, які і роблять бар'єр непроникним. Ми спостерігали за двома критично важливими білками - Клаудина-5 і окклудіном. У новонароджених щурів цих білків в рази більше, ніж у дорослих. Ось чому барвник Evans blue і флуоресцентні мітки у новонароджених особин «застряють» в бар'єрі, в той час як у дорослих він стає більш «лояльним» - проникним для речовин, які в звичайних умовах в мозок не потрапляють.
Чи можливо знайти пояснення різної поведінки мозку в момент його початкового розвитку і коли статус організму вже сформувався? Мозок розвивається за принципом надмірності. Він намагається мати відразу все і багато і тільки потім розбирається, що з цим робити. Частина його структур, наприклад адренергические нейрони, у яких медіаторами служать норадреналін і адреналін, утворюється задовго до народження, але дозріває лише до двох років життя. Інші структури, альфа2-адренорецептори, навпаки, дозрівають до народження у величезній кількості, а після їх щільність помітно знижується. Але так чи інакше, багато молекулярні структури мозку, так само як і його біохімія, формуються свідомо з надлишком. Можливо, це одна з причин, чому у новонароджених спостерігається підвищена експресія «бар'єрних» білків, які перешкоджають проникненню багатьох «дорослих» препаратів, які застосовують при лікуванні інсульту мозку.
Таємниця гематоенцефалічного бар'єру - як грань між небом, землею і повітрям. Його можна «побачити», але важко осягнути. Потрібні бійці-невидимки, які могли б обдурити строгих вартою бар'єру, пронести необхідну «гуманітарну допомогу» страждає мозку маленького пацієнта і допомогти йому в боротьбі з інсультом. Такими помічниками можуть стати транспортні системи - ліпосоми, капсули, вуглецеві нанотрубки, які активно розробляються з цією метою в усьому світі.
Дослідження проводилися на біологічному факультеті Саратовського державного університету ім. Н. Г. Чернишевського в рамках проекту Російського наукового фонду (№ 14-15-00128) та гранту Президента РФ (МД-2216.2014.4).
Чому інсульти мозку у новонароджених та дорослих так різняться?Чи можливо знайти пояснення різної поведінки мозку в момент його початкового розвитку і коли статус організму вже сформувався?
