1 Печінський С.В. 1 Курегян А.Г. 1 Самсонов М.Ю. 2 Іванов А.І. 2
1 П'ятигорський медико-фармацевтичний інститут - філія ГБОУ ВПО ВолгГМУ МОЗ Росії
2 ЗАТ «Р-Фарм»
Немоноксацін є оригінальним, що не містить фтору похідним хінолону. Він володіє ультрашироким спектром антибактеріальної активності як відносно грамнегативних, так і по відношенню до грампозитивних і анаеробних бактерій, включаючи різні резистентні штами стрептококів і стафілококів. На підставі даних залежно «структура - активність» побудована комп'ютерна модель інгібуючої активності хінолонів щодо топоізомерази IV грампозитивнихмікроорганізмів Streptococcus pneumoniae і Staphylococcus aureus. За результатами експерименту встановлено, що фтор в положенні С6 в молекулі фторхінолонів не бере участі в утворенні зв'язків в активному центрі білка, а тільки впливає на просторову конфігурацію ліганду. Модель, побудована in silico, показала, що немоноксацін перевершує по інгібуючої активності деякі фторхінолони, що підтверджується даними in vitro.
Staphylococcus aureus
Streptococcus pneumoniae
фторхінолони
хінолони
топоізомераза IV
молекулярний докінг
Немоноксацін
1. Державний реєстр лікарських засобів [Електронний ресурс]. - Режим: http://grls.rosminzdrav.ru.
2. Мокрушина Г.А., Чарушин В.Н., Чупахін О.М. Взаємозв'язок структури і антибактеріальної активності в ряду фторхінолонів. Огляд // хім.-фарм. журн .. - 1995. - Т. 29. - № 9. - С. 5-19.
3. Комп'ютерна програма ArgusLab [Електронний ресурс]. - Режим доступу: http://www.arguslab.com/arguslab.com/ArgusLab.html (дата звернення: 03.09.2015).
4. Комп'ютерна програма GAMESS [Електронний ресурс]. - Режим доступу: http://www.msg.chem.iastate.edu/gamess/download.html (дата звернення: 03.09.2015).
5. Comparative in vitro activities of the new quinolone nemonoxacin (TG-873870), gemifloxacin and other quinolones against clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis / Che-Kim Tan, Chih-Cheng Lai, Chun-Hsing Liao et al. // J. of Antimicrobial Chemotherapy. - 2009. - V. 64. - Р. 428-435.
6. Dose escalation study of the safety, tolerability, and pharmacokinetics of Nemonoxacin (TG-873870), a novel potent broad-spectrum nonfluorinated quinolone, in healthy volunteers / Luke Lin, Li-Wen Chang, Cheng-Yuan Tsai et al. // Antimicrob Agents Chemother. - 2010. - V. 54. - P. 405-410.
7. In vitro activity of nemonoxacin (TG-873870), a novel non-fluorinated quinolone, against clinical isolates of Staphylococcus aureus, enterococci and Streptococcus pneumoniae with various resistance phenotypes in Taiwan / Yen-Hsu Chen, Chia-Ying Liu, Jang- Jih Lu et al. // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. - 2009. - V. 64.- Р. 1226-229.
8. In vivo antibacterial activity of Nemonoxacin, a novel non-fluorinated quinolone / Cong-Ran Li, Yi Li, Guo-Qing Li et al. // J. Antimicrob Chemother. - 2010. - V. 65. - Р. 2411-2415.
9. Ronald AR, Low DE Fluoroquinolone antibiotics. - Basel - Boston - Berlin: Springer Basel AG, 2003. - 261 p ..
10. Steven Swallow Chapter two - fluorine in medicinal chemistry // Progress in Medicinal Chemistry. - 2015. - V. 54. - P. 65-133.
11. Structural insight into the quinolone-DNA cleavage complex of type IIA topoisomerases / I. Laponogov, MK Sohi, DA Veselkov et al. // Nat. Struct. Mol. Biol. - 2009. - V.16. - P. 667-669.
12. Thomas D. Gootz, Katherine E. Brighty Fluoroquinolone antibacterials: SAR, mechanism of action, resistance, and clinical aspects // Medicinal Research Reviews. - 1996. - V. 16. - № 5. - Р. 433-486.
13. Type IIA topoisomerase inhibition by a new class of antibacterial agents / Benjamin D. Bax, Pan F. Chan, Drake S. Eggleston et al. // Nature. - 2010. - V. 466. - P. 935-940.
Похідні хінолонів є одним з найбільш ефективних і швидко розвиваються класів антибіотиків, які частіше за інших хіміотерапевтичних засобів застосовуються в клінічній практиці. З початку 1960-х рр., Коли родоначальник цього класу - налидиксовая кислота була вперше використана для лікування інфекцій сечостатевої системи, і до сьогоднішнього дня синтезовано більше 10 000 активних сполук цієї групи; близько 400 лікарських засобів, похідних хінолонів, вітчизняного і імпортного виробництва зареєстровані в РФ [1, 4, 9, 10].
З тих пір як в 1983 р було введено в медичну практику норфлоксацин - перший клінічно значимий хінолон, що містить фтор в положенні С6, довгі роки вважалося, що саме цей фармакофор є домінуючим в прояві антимікробної активності [4, 9]. В ряду фторхінолонів були синтезовані кілька тисяч сполук, багато з яких стали безперечними лідерами в групі антибактеріальних засобів (наприклад, ципрофлоксацин).
Проте дослідження останніх років довели, що видалення фтору з положення С6 спільно з деякими модифікаціями в положенні С8 не тільки призводить до підвищення активності, покращує фармакокінетичні характеристики хінолонів, але і знижує побічні ефекти. Особливо важливим є прояв активності не містять фтор хінолонів щодо грампозитивних мікроорганізмів, резистентних до фторхінолонів [9].
Встановлено, що реалізація антимікробної дії хінолонів пов'язана з пригніченням ферменту топоізомерази II (ДНК-гіразу) у грамнегативних і топоізомерази IV у грампозитивних бактерій. Цей фермент виконує функцію підтримки спіральності ДНК, відповідаючи за розрив і відновлення суперскрученості спіралі, що є вирішальним фактором для процесів транскрипції і реплікації ДНК.
В результаті зв'язування хінолонів з ферментом утворюється «потрійний комплекс» - «фермент - субстрат - препарат», який не може не диссоциировать на компоненти, не виконувати функцію ферменту, що призводить до пригнічення біосинтезу ДНК і як наслідок - до загибелі бактеріальної клітини. Висока активність хінолонів швидше за все пов'язана з тим, що в бактеріальних клітинах відсутні ферментні системи, що перешкоджають утворенню «потрійних комплексів», здатними руйнувати ці комплекси або метаболизировать самі хінолони.
Необхідно відзначити, що хінолони не пригнічує топоізомеразу II ссавців, така селективність обумовлена істотними відмінностями в структурі цих ферментів [4, 9, 12].
Немоноксацін є оригінальним, що не містить фтору похідним хінолону. Він володіє ультрашироким спектром антибактеріальної активності як відносно грамнегативних, так і по відношенню до грампозитивних і анаеробних бактерій, включаючи різні резистентні штами стрептококів і стафілококів [5, 7, 8].
Немоноксацін, структурна формула якого наведена на малюнку 1, менш ніж на 20% зв'язується з білками крові, виводиться нирками практично в незмінному вигляді, що доведено в ході клінічних випробувань.
Мал. 1. Структурна формула Немоноксаціна
Для нього in vitro не визначена ингибирующая або індукують активність різних цитохромів Р450. Крім того, для цього хінолону не характерна фотосенсибілізація [6].
Метою даного дослідження є встановлення залежності між структурою Немоноксаціна і його інгібуючої активністю щодо топоізомерази IV на прикладі Staphylococcus aureus і Streptococcus pneumoniae.
Об'єкти і методи дослідження
У дослідженнях використовували програму ArgusLab, розроблену Mark Thompson, Planaria Software Seattle [2], оптимізацію просторової структури ліганду виконували напівемпіричні методом PM3 за допомогою програмного комплексу GAMESS [3]. Це поєднання дозволило отримати більш точну модель взаємодії ліганда з центром зв'язування ферменту. Як об'єкти дослідження були обрані комп'ютерні моделі взаємодії топоізомерази IV з лігандами, побудовані на підставі кристалографічних знімків Streptococcus pneumoniae (PDB код: 3FOF) з величиною дозволу 1,7 Å [11] і Staphylococcus aureus (PDB код: 2XCT) з величиною дозволу 3 , 35 Å [13]. Зіставлення отриманих прогнозів проводили з результатами антимікробної активності деяких похідних фторхінолону: Левофлоксацину, ципрофлоксацину, Моксифлоксацин і Немоноксаціна за даними, отриманими in vitro і опублікованим в роботах [5, 7, 8].
Результати та їх обговорення
Комп'ютерна модель була побудована і апробована на вже відомих взаємодіях топоізомерази IV Streptococcus pneumoniae і топоізомерази IV Staphylococcus aureus з фторхінолонами.
Порівняння проводили по просторовому розташуванню лиганда в активному центрі білка, розрахованому за допомогою комп'ютерної моделі з кристалографічними знімкам, і енергії докінгу.
При розрахунках енергії докінгу враховували гнучкість як ліганда, так і білка. Така техніка «стратегічної гнучкості» дозволила поліпшити прогнозуючу здатність комп'ютерної моделі.
Високий ступінь прогнозу дає можливість використовувати запропоновану модель для встановлення взаємодії Немоноксаціна з топоізомеразою IV Streptococcus pneumoniae і Staphylococcus aureus.
Розташування Немоноксаціна і Моксифлоксацин в активному центрі топоізомерази IV Streptococcus pneumoniae представлено на малюнку 2.
а) 
б) 
в)
Мал. 2. Немоноксацін (а), Моксифлоксацин (б),
Немоноксацін - синій і Моксифлоксацин - зелений (в) в активному сайті зв'язування топоізомерази IV Streptococcus pneumoniae
Близьке просторове розташування молекул Немоноксаціна і Моксифлоксацин в активному центрі топоізомерази IV Streptococcus pneumoniae свідчить про подібний механізм інгібування на молекулярному рівні. При цьому Немоноксацін утворює більш міцні водневі зв'язку в ряду розглянутих препаратів між карбоксильною групою та аміногрупою серотоніну 79 і 80, що швидше за все є ключовим фактором у прояві інгібуючої дії. Слід зазначити, що при цьому фтор молекул фторхінолонів не утворює зв'язків з активним центром ферменту.
Результати розрахунку енергії докінгу взаємодії Левофлоксацину, ципрофлоксацину, Моксифлоксацин, Немоноксаціна з топоізомеразою IV Streptococcus pneumoniae і зіставлення результатів in silico з даними антимікробної активності цих сполук, отриманими in vitro [5, 7, 8], представлені в таблиці 1.
Таблиця 1
Енергія докінгу і ингибирующая активності хінолонів відносно Streptococcus pneumoniae
ліганди
Енергія докінгу (ккал / М)
MIC50 (мг / л)
левофлоксацин
-9,781
4
ципрофлоксацин
-11,365
2
моксифлоксацин
-13,244
1
Немоноксацін
-15,562
0,25
Як випливає з даних таблиці 1, спостерігається кореляція розрахованої енергії докінгу і результатів інгібуючої активності в розглянутому ряду лікарських засобів.
Для прояву інгібуючої активності Левофлоксацину необхідна найбільша концентрація - 4 мг / л, при цьому енергія докінгу становить -9,781 ккал. Проміжне становище в порівнюваних препаратах займають Ципрофлоксацин і Моксифлоксацин з мінімальної інгібуючої концентрацією 2 мг / л (-11,365 ккал) і 1 мг / л (-13,244 ккал) відповідно. Немоноксацін володіє інгібуючої активністю щодо Streptococcus pneumoniae в мінімальної концентрації - 0,25 мг / л (-15,562 ккал) в порівнянні з левофлоксацин, Ципрофлоксацином і Моксифлоксацин.
Таким чином, спостерігається повний збіг результатів прогнозу, отриманого in silico, і незалежно отриманих результатів [5, 7, 8] in vitro.
Далі було вивчено взаємодію Немоноксаціна і ципрофлоксацину з активним центром топоізомерази IV Staphylococcus aureus.
Розташування лігандів в просторі ферменту представлено на малюнку 3.
Немоноксацін, на відміну від розглянутих фторхінолонів, займає більш вигідне просторове розташування в активному центрі топоізомерази IV Staphylococcus aureus, що пов'язано з утворенням водневого зв'язку між карбоксильною групою і аспарагін 476, довжина якої становить 2,2 Å, тоді як, наприклад, Ципрофлоксацин утворює між карбоксильної групою і серотоніном 1084 водневу зв'язок довжиною 2,5 Å, а також наявністю додаткових водневих зв'язків між метокси-групою і аргініном 458, і між первинною аміногрупою в радикала в 7-му положе ванні і аспарагінової кислотою 437.
а) 
б) 
в)
Мал. 3. Ципрофлоксацин (а), Немоноксацін (б),
Немоноксацін - синій і Ципрофлоксацин - зелений (в) в активному сайті зв'язування топоізомерази IV Staphylococcus aureus
Крім того, встановлено, що фтор, що входить в структуру фторхінолонів, не утворює зв'язків в активному центрі топоізомерази IV Staphylococcus aureus.
Наступним етапом дослідження було визначення енергії докінгу взаємодії Левофлоксацину, ципрофлоксацину, Моксифлоксацин, Немоноксаціна з активним центром топоізомерази IV Staphylococcus aureus. Порівняльні результати віртуального прогнозу з даними, отриманими in vitro [5, 7, 8], представлені в таблиці 2.
Таблиця 2
Енергія докінгу і ингибирующая активність хінолонів відносно Staphylococcus aureus
ліганди
енергія докінгу
(Ккал / М)
MIC50 (мг / л)
левофлоксацин
-13,163
0,125
ципрофлоксацин
-13,477
0,125
моксифлоксацин
-16,928
0,032
Немоноксацін
-17,211
0,030
Розрахунок енергії докінгу взаємодії хінолонів з топоізомеразою IV Staphylococcus aureus показав, що Немоноксацін проявляє найвищу ингибирующую активність в порівнянні з фторхінолонами.
Антимікробна активність Левофлоксацину і ципрофлоксацину проявляється при однаковій мінімальної концентрації - 0,125 мг / л. Для реалізації інгібуючої активності Моксифлоксацин і Немоноксаціна потрібно концентрація близько 0,03 мг / л.
Порівняння даних енергії докінгу і інгібуючої активності показує узгодженість результатів досліджень, отриманих in silico і in vitro.
висновки
Розроблена комп'ютерна модель взаємодії лігандів з топоізомеразою IV грампозитивнихмікроорганізмів Streptococcus pneumoniae і Staphylococcus aureus дозволяє проводити дослідження в ряду «структура - активність», що є важливою умовою при розробці нових високоактивних лікарських засобів із заданим фармакологічною дією.
Прогноз антимікробної активності за допомогою молекулярного докінгу деяких похідних хінолону підтверджується результатами in vitro, що свідчить про високу прогнозуючої здатності розробленої моделі.
Встановлено, що фтор в положенні С6 в молекулі фторхінолонів не бере участі в утворенні зв'язків в активному центрі білка, а тільки впливає на просторову структуру ліганду. У зв'язку з цим наявність фтору в положенні С6 не є вирішальним фактором у прояві антимікробної дії і підтверджує перспективність пошуку нових що не містять фтору похідних хінолону.
В результаті проведених досліджень було встановлено, що що не містить фтору похідне хінолону Немоноксацін проявляє більш виражену інгібуючу активність щодо топоізомерази IV грампозитивнихмікроорганізмів Streptococcus pneumoniae і Staphylococcus aureus в порівнянні з фторхінолонами.
рецензенти:
Оганесян Е.Т., д.фарм.н., професор кафедри органічної хімії Пятигорского медико-фармацевтичного інституту - філії ГБОУ ВПО ВолгГМУ МОЗ України, м П'ятигорськ;
Степанова Е. Ф., д.фарм.н., професор, професор кафедри технології ліків П'ятигорського медико-фармацевтичного інституту - філії ГБОУ ВПО ВолгГМУ МОЗ України, м П'ятигорськ.
бібліографічна посилання
Печінський С.В., Курегян А.Г., Самсонов М.Ю., Іванов А.І. ВИВЧЕННЯ інгібує активність НЕМОНОКСАЦІНА - НОВОГО, НЕ МІСТИТЬ ФТОР, похідні хінолону ЩОДО Топоізомерази IV МЕТОДОМ Молекулярний Докінг // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2015. - № 5 .;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=22249 (дата звернення: 08.07.2019).
Пропонуємо вашій увазі журнали, що видаються у видавництві «Академія природознавства»
(Високий імпакт-фактор РИНЦ, тематика журналів охоплює всі наукові напрямки)
Ru/ru/article/view?